福辛普利对胰岛素抵抗小鼠脂联素及心肌细胞凋亡的影响

栏目：论著

（1.宁夏医科大学总医院心脑血管病医院，宁夏    银川    750004；2.宁夏医科大学总医院心脏中心干部病房，宁夏    银川    750004）

资助项目：国家自然科学基金资助项目（81360026）

^*通信作者：杨锐英，E-mail：yangruiying@medmail.com.cn

摘要：目的    观察福辛普利对胰岛素抵抗（IR）小鼠心肌组织中脂联素（APN）表达及心肌细胞凋亡的影响。方法    采用随机数字表法将40只C57BL/6野生型小鼠分为正常对照组、IR组、Fos7.5组和Fos15组，每组10只。正常对照组给予普通饲料喂养，其余三组均给予高脂饲料喂养，Fos7.5组和Fos15组分别给予7.5 mg/（kg·d）和15 mg/（kg·d）福辛普利灌胃干预。喂养12周后，称量体质量，测定空腹血糖（FPG），ELISA法检测血清空腹胰岛素（FINS）水平，并计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），TUNEL法检测心肌细胞凋亡，Western blot测定心肌组织中APN表达情况。结果    4组小鼠体质量、FPG、FINS、HOMA-IR、APN水平比较差异有统计学意义（P<0.05）。IR组、Fos7.5组体质量、FPG、FINS及HOMA-IR水平均高于正常对照组，Fos15组低于IR组、Fos7.5组，差异有统计学意义（P<0.05），而Fos15组与正常对照组体质量、FPG、FINS、HOMA-IR水平比较差异无统计学意义。IR组、Fos7.5组心肌细胞凋亡率高于正常对照组，Fos15组低于IR组、Fos7.5组，差异有统计学意义（P<0.05）；Fos15组与正常对照组心肌细胞凋亡率比较差异无统计学意义。IR组APN表达水平低于正常对照组，而Fos7.5组、Fos15组高于IR组及正常对照组，Fos15组高于Fos7.5组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论    胰岛素抵抗可以引起心肌细胞凋亡，福辛普利可呈剂量依赖性改善胰岛素抵抗小鼠心肌细胞凋亡，可能与心肌组织中APN表达水平增高有关。

关键词：福辛普利；胰岛素抵抗；脂联素；心肌细胞凋亡

Effects of Fosinopril on adiponectin and cardiomyocyte apoptosis in insulin resistant mice

REN Yongkang¹, Ma Yan¹, YANG Ruiying²*

（1. Hospital of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan, Ningxia, 750004, China; 2. Cadre’ s Ward of Heart Centre, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan, Ningxia, 750004, China）

Abstract：Objective    To observe the effect of Fosinopril on adiponectin (APN) expression and apoptosis in myocardium of insulin resistant (IR) mice. Methods  Forty C57BL/6 wild-type mice were randomly divided into normal control group, IR group, Fos 7.5 group and Fos 15 group, with ten mices in each group. The normal control group was fed with common diet, while the other three groups were fed with high fat diet. Fos 7.5 group and Fos 15 group were given different doses of Fosinopril intragastric intervention. After 12 weeks of feeding, weight was weighed, fasting blood glucose was measured, fasting insulin was measured by ELISA, and insulin resistance index (HOMA-IR) was calculated. Myocardial apoptosis was detected by TUNEL, and APN expression in myocardium was measured by Western blot. Results  There were statistically significant differences in body weight, FPG, FINS, HOMA-IR, and APN levels among the four groups of mice (P<0.05). The body mass, FPG, FINS, and HOMA-IR levels of the IR group and Fos7.5 group were higher than those of the normal control group, while the Fos15 group was lower than those of the IR group and Fos7.5 group, with the differences were statistically significance (P<0.05). However, there was no statistically significant difference in body mass, FPG, FINS, and HOMA-IR levels between the Fos15 group and the normal control group. The apoptosis rate of myocardial cells in the IR group and Fos7.5 group were higher than those in the normal control group, while the Fos15 group was lower than that in the IR group and Fos7.5 group, with the differences were statistically significance (P<0.05), there was no statistically significant difference in the apoptosis rate of myocardial cells between the Fos15 group and the normal control group. The expression level of APN in the IR group was lower than that in the normal control group, while the Fos7.5 group and Fos15 group were higher than that in the IR group and normal control group, the Fos15 group was higher than the Fos7.5 group, and the differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion  Insulin resistance can induce cardiomyocyte apoptosis. Fosinopril can improve cardiomyocyte apoptosis in insulin-resistant mice in a dose-dependent manner, which may be related to the increased expression of APN in myocardium.

Key words： Fosinopril；Insulin resistance；Adiponectin；Cardiomyocyte apoptosis

胰岛素抵抗是指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。有研究表明，胰岛素抵抗可引起心肌细胞变性坏死、凋亡增加^[1]。脂联素（adiponectin，APN）是一种胰岛素超敏化激素，可由脂肪细胞分泌，也可由骨骼肌、内皮细胞、心肌细胞分泌，在心肌组织中主要和APN受体1结合发挥生物学作用，可提高葡萄糖摄取，改善胰岛素敏感性，对胰岛素抵抗所致心肌损伤有一定保护作用^[2-3]。福辛普利被广泛应用于临床，其作用除了降压外还可以改善胰岛素抵抗及左心室肥厚等。有研究表明，福辛普利可呈剂量依赖性升高血清APN水平，并上调心肌APN受体1的表达^[4]。基于此，本研究旨在观察胰岛素抵抗小鼠中心肌细胞凋亡及APN水平的表达情况，探讨福辛普利对胰岛素抵抗及心肌细胞凋亡的作用，现报道如下。

1   材料与方法

1.1    实验动物分组及饲养    6周龄雄性C57BL/6野生型小鼠40只，体质量（16.18～16.89)g，购自北京维通利华实验动物公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001。用随机数表法将小鼠分为4组：正常对照组、IR组、Fos7.5组和Fos15组，每组10只。正常对照组给予普通饲料喂养，其余三组给予高脂饲料喂养，诱导建立胰岛素抵抗小鼠模型，高脂饲料代码：SJQX0009949，购自美国Research Diet公司。正常对照组和IR组给予0.5%羧甲基纤维素钠（天津市华盛化学试剂有限公司，符合GB1262-92，规格：500 g）灌胃，Fos7.5组和Fos15组分别给予福辛普利钠片（中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H19980197，规格：10 mg×14片）7.5 mg/（kg·d）和15 mg/（kg·d）溶于0.5%羧甲基纤维素钠灌胃。于宁夏医科大学实验动物中心饲养，饲养级别为SPF级，室温22～24 ℃，相对湿度为50%，光照时间8:00～20:00，饲养12周。

1.2    标本采集、实验室指标检测    饲养结束后，禁食12 h，取尾血检测空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）（血糖仪及血糖试纸条购自美国强生公司），4%水合氯醛腹腔麻醉，眼球取血，待全血在冰盒中静置1 h后，使用购自美国EPPENDORF公司的低温高速离心机5810R以5 000 r/min在4 ℃低温下离心5 min，分离血清，分装后﹣80 ℃冰箱保存待测。采用ELISA法（试剂盒购自美国R＆D公司）检测血清空腹胰岛素（fasting insulin，FINS），计算胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment of insulin resistance index，HOMA-IR），HOMA-IR=（FPG×FINS）/22.5。取血后迅速剪开胸腔，取出心脏，并取分别取同一位置心肌组织置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋待用。其余心肌组织过液氮后存放于﹣80℃冰箱保存待用。

1.3    TUNEL法检测心肌细胞凋亡    将切好的石蜡切片进行脱蜡、梯度乙醇浸洗、PBS缓冲液漂洗，在37 °C恒温箱中用蛋白酶K（Proteinase K）工作液处理组织，胎牛血清封闭液封闭制成玻片。制备TUNEL反应混合液：为校准TUNEL反应混合液准确性，避免假阳性及假阴性结果出现，每次检测时均增加一个阳性对照组，一个阴性对照组，而其余待检测样本均为处理组，用50 μl 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）＋450 μl脱氧尿三磷酸（dUTP）液混匀；一份为阴性对照组，仅加50 μl dUTP液；一份为阳性对照组，先加入100 μl脱氧核糖核酸酶1（DNase1），后面步骤同处理组。待玻片干后，加50 μl TUNEL反应混合液于标本上，待玻片干后加转化剂-POD（converter-POD）于标本上；根据（二氨基联苯胺）DAB显色试剂盒说明配制DAB显色液，然后在避光条件下进行显色，在购自日本OLYMPUS公司的光学显微镜STM6下观察心肌细胞凋亡情况，当出现棕黄色细胞核且背景不深时立即用PBS漂洗，再用苏木素复染，自来水冲洗，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。用光学显微镜拍照，棕黄色细胞核表示凋亡细胞核，通过IPP软件计算心肌细胞凋亡率（心肌细胞凋亡率=凋亡细胞核数/细胞核总数）。

1.4    Western bot法检测小鼠心肌组织中APN表达水平    取少量心肌组织，用蛋白提取试剂盒提取全蛋白，并用BAC蛋白检测试剂盒测定总蛋白浓度。取50 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)，然后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h后，APN兔单克隆抗体4 ℃孵育过夜，次日用对应APN兔单克隆抗体孵育1 h，滴加ECL发光液后，采用购自山东霍尔德电子科技有限公司的化学发光仪HD-NC600L直接显影。对目的蛋白和β-tubulin条带进行灰度分析，计算吸光度（optical density，OD）值，用目的蛋白的OD值/β-tubulin的OD值表示目的蛋白的相对表达量。

1.5    统计学方法    采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计量资料以“x±s”，多组间比较用单因素方差分析（one-wayANOVA），组间多重比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1    4组小鼠体质量、FPG、FINS及HOMA-IR比较    4组小鼠体质量、FPG、FINS、HOMA-IR水平比较差异有统计学意义（P<0.05）。IR组、Fos7.5组体质量、FPG、FINS及HOMA-IR水平均高于正常对照组，Fos7.5组FPG、FINS及HOMA-IR水平均低于IR组，差异有统计学意义（P<0.05）；IR组与Fos7.5组体质量比较差异无统计学意义；Fos15组与正常对照组体质量、FPG、FINS、HOMA-IR水平比较差异无统计学意义；Fos15组体质量、FPG、FINS、HOMA-IR水平均低于IR组、Fos7.5组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1    四组小鼠体质量、FPG、血清FINS及HOMA-IR指标比较（x±s）

Table 1    Comparison of FPG and Fins and HOMA-IR in four groups(x±s)

注：FPG，指小鼠空腹血糖；FINS，指小鼠血清空腹胰岛素；HOMA-IR，指胰岛素抵抗指数。与正常对照组比较，^aP＜0.05；与IR组比较，^bP＜0.05；与Fos7.5组比较，^cP＜0.05

2.2    4组小鼠心肌细胞凋亡情况比较    IR组、Fos7.5组心肌细胞凋亡率高于正常对照组，且Fos7.5组低于IR组，差异有统计学意义（P<0.05）；Fos15组与正常对照组心肌细胞凋亡率比较差异无统计学意义，但Fos15组低于IR组、Fos7.5组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1及表2。

图1    四组小鼠心肌细胞凋亡结果（400×）

Figure 1  Apoptosis of cardiomyocytes of mice in four groups(400×)

注：A，正常对照组；B，IR组；C，Fos7.5组；D，Fos15组

表2    四组小鼠心肌组织细胞凋亡率比较（x±s）

Table 2  Comparison of apoptotic rate of myocardial tissue of mice in four groups（x±s）

注：与正常对照组比较，^aP<0.05；与IR组比较，^bP< 0.05；与Fos7.5组比较，^cP< 0.05；

2.3    Western blot法检测心肌组织中APN表达水平    IR组APN表达水平低于正常对照组，而Fos7.5组、Fos15组高于IR组及正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；Fos15组APN表达水平高于Fos7.5组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2、表3。

图2  Western blot检测小鼠心肌组织APN表达水平

Figure 2  Comparison of myocardial APN expression with Western blot

注：A，正常对照组；B，IR组；C，Fos7.5组；D，Fos15组。

表3    四组小鼠心肌组织APN表达水平比较（x±s）

Table 3  Comparison of APN expression levels in myocardial tissues between the four groups of mice（x±s）

注：与正常对照组比较，^aP<0.05；与IR组比较，^bP< 0.05；与Fos7.5组比较，^cP< 0.05；

3  讨论

胰岛素抵抗是由遗传和环境因素共同参与，使机体对胰岛素敏感性降低，引起机体高胰岛素血症的状态。肥胖是最常见的环境因素，长期高脂饮食可引起不同程度的胰岛素抵抗^[5]。本研究显示，采用高脂饲料喂养后小鼠体重明显增加，IR组小鼠FPG、FINS及HOMA-IR均升高，提示胰岛素抵抗模型诱导成功。本研究结果显示，胰岛素抵抗组小鼠心肌细胞凋亡率明显增加，提示胰岛素抵抗发生时伴随着心肌细胞凋亡的发生。有研究表明^[6]，胰岛素抵抗可引起氧化应激、炎症、内皮细胞功能紊乱、代谢失衡、离子内环境异常和间质纤维化，而这些均可引起心室重构、心肌细胞凋亡等心肌损伤。可能机制是胰岛素抵抗发生时许多炎性因子表达增多，并伴随高胰岛素血症，进而促进动脉壁平滑肌细胞增殖，诱发并加重动脉粥样硬化，从而引起心肌细胞缺血及凋亡；也可能胰岛素抵抗发生时一氧化氮产生增多，进而直接促进细胞凋亡。

本研究结果显示，IR组小鼠心肌组织APN表达下降，表明胰岛素抵抗发生时伴随APN表达水平降低，提示APN下降和胰岛素抵抗可能共同参与了心肌细胞的凋亡。有研究发现，APN具有提高胰岛素敏感性、改善胰岛素抵抗的作用，代谢综合征患者存在APN低表达情况^[7]。另有研究认为，APN可以减少心肌细胞凋亡，改善心室重构，对心肌细胞具有保护作用^[8]。其机制可能是APN在心肌组织中与APN受体1结合，增加PPAR-α的活性，进而增强机体对葡萄糖的摄取，增加心肌细胞能量代谢，减少心肌细胞凋亡；APN也可降低氧化、硝化应激及蛋白激酶B的活化，进而保护心肌细胞，减少凋亡。因此，胰岛素抵抗与心肌细胞凋亡具有同向关系，胰岛素抵抗加重时心肌细胞凋亡也加重，这可能与心肌组织中APN表达下降有关。

本研究结果显示，Fos7.5组、Fos15组小鼠FPG、FINS水平及HOMA-IR均低于IR组（P<0.05），心肌细胞凋亡较IR组改善，且Fos15组效果更明显，表明福辛普利可以同时减轻胰岛素抵抗、改善心肌细胞凋亡，且呈剂量依赖性。证实了福辛普利可以减轻胰岛素抵抗，并在预防和抑制心肌细胞损伤上发挥重要作用^[4]。本研究结果还显示，Fos7.5组、Fos15组小鼠APN表达水平高于IR组（P<0.05），且Fos15组高于Fos7.5组（P<0.05）。提示福辛普利改善胰岛素抵抗及心肌细胞凋亡可能与APN表达升高有关，且呈剂量依懒性。有研究表明，APN改善胰岛素抵抗的作用主要是通过与心肌组织中的APN受体1结合发挥作用，APN受体1通过增强对腺苷酸活化蛋白激酶和过氧化物酶体增殖物等激活受体α的调节，从而促进脂肪酸β氧化，增加葡萄糖的摄取及利用，抑制糖原合成，进而提高对胰岛素的敏感性，改善胰岛素抵抗^[9-10]。APN改善心室重构主要是通过与靶器官APN受体1结合后促进腺苷酸活化蛋白激酶磷酸化，进而增加过氧化物酶体增殖物激活受体α，抑制脂多糖诱发的血管外膜成纤维细胞增殖、迁移和转化，从而抑制心室重构。另外，APN可以通过抑制内皮细胞增殖，增加一氧化氮合成，改善内皮功能，从而对血管及心脏重构产生重要作用^[11-12]。因此，福辛普利可能通过升高血清及心肌组织中APN水平，从而减轻胰岛素抵抗，改善心肌细胞凋亡。

综上所述，高脂饲料喂养小鼠可以诱发胰岛素抵抗，增加心肌细胞凋亡，福辛普利可以改善胰岛素抵抗及心肌细胞凋亡，并存在剂量依赖性，可能与心肌组织中APN表达升高有关。

参考文献

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