姜黄素对脑胶质瘤细胞生物学行为抑制作用及其与Wnt/β-catenin信号通路的关系

论著

（1.北京大学国际医院神经外科，北京  102206；2.中国中医科学院中药所，北京  100700）

摘要： 目的  探讨姜黄素对脑胶质瘤细胞生物学行为抑制作用及其与Wnt/β-catenin信号通路的关系。方法  以人脑胶质瘤U251细胞为研究对象，分别采用0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L和100μmol/L浓度姜黄素进行处理24h、48h、72h，MTT法检测姜黄素对脑胶质瘤细胞增殖的影响，流式细胞术检测姜黄素对脑胶质瘤细胞凋亡的影响，Transwell小室检测姜黄素对脑胶质瘤细胞侵袭的影响，Western blot 实验检测β-catenin 以及Wnt/β-catenin 下游信号分子cyclin D1和c-Myc蛋白表达。结果  姜黄素可抑制人脑胶质瘤U251细胞增殖和侵袭，促进人脑胶质瘤U251细胞凋亡，且其上述作用均具有时间-剂量依赖性。下调β-catenin、cyclin D1和c-Myc蛋白表达，且其上述作用均具有剂量依赖性。结论  姜黄素可抑制脑胶质瘤细胞增殖侵袭等生物学行为，其可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路达到脑胶质瘤细胞生物学行为抑制作用。

关键词： 姜黄素；脑胶质瘤细胞；生物学行为；抑制；Wnt/β-catenin；信号通路；关系

Inhibitory effect of curcumin on biological behavior of glioma cells and its relationship with Wnt/beta-catenin signaling pathway

Duan Ran¹, Cui Xiaolan², Shi Yujing²

(1. Department of Neurosurgery, Peking University International Hospital, Beijing, 102206, China; 2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing, 100700, China)

Abstract: Objective  To investigate the inhibitory effect of curcumin on the biological behavior of glioma cells and its relationship with Wnt/beta-catenin signaling pathway. Methods  Human glioma U251 cells were treated with curcumin at 0μmol/L, 25μmol/L, 50μmol/L and 100 μmol/Lconcentrations for 24, 48 and 72 hours respectively. MTT colorimetry was used to detect the effect of curcumin on the proliferation of glioma cells, flow cytometry was used to detect the effect of curcumin on apoptosis of glioma cells, and Transwell chamber was used to detect the invasion of curcumin on glioma cells. Western blot assay was used to detect the expression of β-catenin and the downstream signal molecules of Wnt/beta-catenin which was cyclin D1 and c-Myc. Results  Curcumin inhibited the proliferation and invasion of human glioma U251 cells, promoted the apoptosis of human glioma U251 cells, and the above effects of it were time-and dose-dependent. Curcumin can down-regulated the expression of β-catenin, cyclin D1 and c-Myc proteins, and the above effects of it were dose-dependent. Conclusion  Curcumin can inhibit the biological behavior of glioma cells such as proliferation and invasion. Curcumin may inhibit the biological behavior of glioma cells by regulating Wnt/beta-catenin signaling pathway.

Key words: Curcumin; Glioma cells; Biological behavior; Inhibition; Wnt/beta-catenin; Signaling pathway; Relationship

脑胶质瘤为临床常见神经系统恶性肿瘤，其早期无明显特异性症状，病情发展迅速，且治疗后容易复发，预后情况较差^[1-2]。对脑胶质瘤进行防治以改善其疗效和预后十分必要。尽管目前脑胶质瘤等恶性肿瘤的治疗干预取得了较大进展，然而其预后情况仍较差。因此，需寻找有效的脑胶质瘤治疗药物以改善其预后状况。姜黄素可抗氧化抗炎，近年来的实验研究证实了其在多种恶性肿瘤干预中的应用效果较好，而Wnt/β-catenin信号通路为其干预途径之一^[3-4]。本研究亦采用姜黄素进行人脑胶质瘤细胞的体外实验干预，关注了其对脑胶质瘤生物学行为的影响及Wnt/β-catenin信号通路可能在其中的作用，具体研究方法以及研究结果如下。

1  资料与方法

1.1  实验材料与来源  人脑胶质瘤U251细胞来自中国科学院细胞生物学研究所，微量移液器（德国艾本德），细胞培养箱、胰蛋白酶、多聚甲醛、凝胶图像分析仪（美国Thermo）、Transwell小室（美国BD），流式细胞仪、酶标仪（美国BD），显微镜（日本Olympus），电泳仪（美国Bio-Rad），BCA蛋白定量试剂盒（美国Pierce），RPMI-1640培养基、胎牛血清、MTT（美国Gibco），二甲基亚砜（DMSO）（美国Amersco），AnnexinV-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒（武汉艾美捷），电泳仪（北京六一）。

1.2  实验方法 

1.2.1  细胞培养  以人脑胶质瘤U251细胞为研究对象，采用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基进行细胞培养，在37 ℃ 、5% CO₂体积分数、饱和湿度培养箱中培养至融合度80%，以0.25%的胰蛋白酶进行消化并行2～3代传代培养，取对数生长期细胞进行实验研究。

1.2.2  药物处理  培养液稀释细胞悬液至浓度2×10⁴/mL，接种于96孔板中，每孔100μl，在37 ℃ 、5% CO₂体积分数、饱和湿度培养箱中培养至细胞贴壁，每24孔为一组，分别替换含0μmol/L（即对照孔）、25μmol/L、50μmol/L和100μmol/L浓度姜黄素培养液，进行37 ℃ 、5% CO₂体积分数、饱和湿度培养箱中培养24h、48h、72h。

1.2.3  MTT 法检测姜黄素对脑胶质瘤细胞增殖的影响  分别各取8孔添加20μl的MTT，4h后终止培养，吸去培养液后添加DMSO 150μl，10min后酶标仪读取570nm波长处吸光度（OD），计算细胞生长抑制率（IR），计算依据为公式IR=（1-实验孔OD/对照组OD）×100%。

1.2.4  流式细胞术检测姜黄素对脑胶质瘤细胞凋亡的影响  细胞分组和姜黄素处理同1.2.2，处理24h、48h、72h后细胞消化为1×10⁶/ml单细胞悬液，添加10µl APC-Annexin V，避光反应5min，吸去培养液后添加100µl缓冲液，培养1h后上流式细胞仪检测细胞凋亡状况。

1.2.5  Transwell小室检测姜黄素对脑胶质瘤细胞侵袭的影响  细胞分组和姜黄素处理同1.2.2，处理24h、48h、72h后细胞数为5×10⁵/ml单细胞悬液，取单细胞悬液200µl添加至含10% 胎牛血清以及和900µl 640培养液的Transwell小室，在37 ℃ 、5% CO₂体积分数、饱和湿度培养箱中12h，4%多聚甲醛固定半小时后0.1%结晶紫染色，显微镜下放大观察，统计细胞穿膜数。

1.2.6  Western blot实验检测β-catenin以及Wnt/β-catenin下游信号分子cyclin D1和 c-Myc 蛋白表达  细胞分组和姜黄素处理同1.2.2，处理24h后离心收集细胞，常规进行细胞裂解和蛋白提取，添加0.5μg目标基因 BCA 蛋白定量试剂，室温（20℃）孵育半小时，15 g/L琼脂糖凝胶电泳 （含0.5mg/L溴化乙锭） 并通过相应的凝胶图像分析仪进行目标基因蛋白表达情况分析。

1.3  统计学方法  采用SPSS22.0软件包进行数据的统计学分析，计量资料均符合正态分布，以“x±s”形式表示，多组计量资料比较采用单因素方差分析，并采用Dunnett t检验进行进一步两两比较，以α=0.05为检验水准。

2  结果

2.1  姜黄素对人脑胶质瘤U251细胞生物学行为的影响分析  姜黄素可抑制人脑胶质瘤U251细胞增殖和侵袭，促进人脑胶质瘤U251细胞凋亡，且其上述作用均具有时间-剂量依赖性，见表1。

表1  姜黄素对人脑胶质瘤U251细胞生物学行为的影响分析

Table 1  Effect of curcumin on biological behavior of human glioma U251 cells

续表

续表

2.2  姜黄素对人脑胶质瘤U251细胞β-catenin以及Wnt/β-catenin下游信号分子蛋白表达的影响  姜黄素可下调人脑胶质瘤U251细胞β-catenin、cyclin D1和c-Myc蛋白表达，且其上述作用具有剂量依赖性，见图1～图3。

图1  不同浓度姜黄素对人脑胶质瘤U251细胞β-catenin蛋白表达影响的Western blot结果

Figure 1  Western blot results of the effects of curcumin at different concentrations on the expression of beta-catenin in human glioma U251 cells

图2  不同浓度姜黄素对人脑胶质瘤U251细胞cyclin D1蛋白表达影响的Western blot结果

Figure 2  Western blot results of the effects of curcumin at different concentrations on cyclin D1 protein expression in human glioma U251 cells

图3  不同浓度姜黄素对人脑胶质瘤U251细胞c-Myc蛋白表达影响的Western blot结果

Figure 3  Western blot results of the effects of curcumin at different concentrations on c-Myc protein expression in human glioma U251 cells

3  讨论

随着人口老龄化的发展以及生活环境的变化，各系统恶性肿瘤的发生不断增加。脑胶质瘤是常见神经系统癌变，约占神经系统恶性肿瘤的一半，其病情进展快，且可出现侵袭转移，加重病情，影响疗效和预后^[5-6]。放化疗是脑胶质瘤常用干预方法，然而其疗效较差，治疗后常可出现复发等问题，加重患者疾病治疗困难程度，甚至导致死亡等不良预后状况的出现^[7]。因此，寻找更安全有效的脑胶质瘤干预药物是目前研究热门课题。

近年来，中医药技术在抗癌治疗中的效果得到认可，在临床中的应用不断推广。姜黄素是从植物姜黄中提取的酚性色素，其毒性低且生物活性广泛，已被多个研究证实可抗氧化、消炎、抗病毒和治疗肿瘤疾病，可通过诱导肿瘤细胞的凋亡、组织细胞周期进展和抑制细胞增殖以及抑制肿瘤血管生成等多种途径达到抗癌作用^[8]。姜黄素应用于乳腺癌、肺癌等肿瘤治疗中可有效抑制细胞增殖，减少肿瘤数目，缩小肿瘤体积，抑制肿瘤进展，且其在肿瘤发生中的抑制作用也得到了认可，且已有研究表明，姜黄素应用于脑胶质瘤的干预效果良好^[9]。本研究亦采用姜黄素对人脑胶质瘤U251细胞进行干预，观察了不同浓度和不同作用时间下脑胶质瘤U251细胞的增殖凋亡情况以及侵袭能力变化，研究结果显示，随着姜黄素浓度的升高，其脑胶质瘤U251细胞增殖抑制率以及细胞凋亡率均不断升高，而 Transwell小室实验中的穿膜细胞数则不断降低，细胞侵袭能力被抑制，证实了姜黄素抑制人脑胶质瘤细胞恶性生物学行为的效果以及其作用具有一定的剂量依赖性。且本研究中，随着姜黄素作用时间的延长，其中的脑胶质瘤U251细胞增殖抑制率以及细胞凋亡率均不断升高，而 Transwell小室实验中的穿膜细胞数则不断降低，表明姜黄素抑制人脑胶质瘤细胞恶性生物学行为作用亦具有一定的时间依赖性，适当增加姜黄素用药剂量，延长其疗程可能有利于其抗癌作用的改善。

肿瘤的发生发展涉及多个病理过程和相关信号通路，其中Wnt/β-catenin信号通路是与肿瘤细胞周期和增殖密切相关基因，其中Wnt为原癌基因，参与肿瘤细胞生长分化的调节，β-catenin为Wnt信号通路中最诶关键的通道传递分子，而β-catenin转移至核内则表明Wnt/β-catenin信号通路的激活^[10]。通常情况下，癌细胞的Wnt通路激活而β-catenin降解抑制，可引发细胞周期调控的异常而导致肿瘤的形成和发展^[11]。已有研究证实姜黄素可通过作用于Wnt/β-catenin信号通路达到肿瘤抑制目的^[12]。本研究亦关注姜黄素对人脑胶质瘤细胞中Wnt/β-catenin信号通路β-catenin以及Wnt/β-catenin下游信号分子cyclinD1和c-Myc蛋白表达的影响，研究结果显示，随着姜黄素浓度的升高，其脑胶质瘤U251细胞中Wnt/β-catenin信号通路β-catenin以及Wnt/β-catenin下游信号分子cyclinD1和c-Myc蛋白表达水平降低，姜黄素下调脑胶质瘤U251细胞中Wnt/β-catenin信号通路β-catenin以及Wnt/β-catenin下游信号分子cyclinD1和c-Myc蛋白表达从而影响其生物学行为的作用具有一定的剂量依赖性。

综上所述， 姜黄素可抑制脑胶质瘤细胞增殖侵袭等恶性生物学行为并促进癌细胞凋亡，其作用机可能为通过下调Wnt/β-catenin信号通路相关分子表达达到脑胶质瘤细胞生物学行为调控效果。

参考文献

[1]  Huo XY, Zhang XY, Yuan F, et al. HOXB7 promotes proliferation and metastasis of glioma by regulating the Wnt/β-catenin pathway[J].  Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2019, 23(6):2476-2485.

[2]  Suwala AK, Koch K, Rios DH, et al. Inhibition of Wnt/beta-catenin signaling downregulates expression of aldehyde dehydrogenase isoform 3A1 (ALDH3A1) to reduce resistance against temozolomide in glioblastoma in vitro[J].  Oncotarget, 2018,9(32):22703-22716.

[3]  白若冰,荔志云,任海军.中医中药在脑胶质瘤治疗中的作用研究[J].西部中医药,2018,31(1):134-137.

[4]  陈海滔,徐超,姚庆华.姜黄素通过调节Wnt/β-catenin信号通路抑制结肠癌细胞上皮间质转化[J].肿瘤学杂志,2017,23(01):35-39.

[5]  Khan M, Muzumdar D, Shiras A. Attenuation of Tumor Suppressive Function of FBXO16 Ubiquitin Ligase Activates Wnt Signaling In Glioblastoma[J]. Neoplasia, 2019, 21(1):106-116.

[6]  Zhang J, Cai H, Sun L, et al. LGR5, a novel functional glioma stem cell marker, promotes EMT by activating the Wnt/β-catenin pathway and predicts poor survival of glioma patients[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2018,37(1):225.

[7]  李靖远,许在华,孙靖驰,等.脑胶质瘤EGFR基因及对放化疗预后的影响[J].中华神经外科疾病研究杂志,2018,17(01):32-34.

[8]  吴涛,刘宏斌,高玉红,等.姜黄素通过COX-2抑制人脑胶质瘤细胞趋化运动和侵袭[J].中国临床神经外科杂志,2017,22(02):89-91+94.

[9]  王瑞嘉,蔡金全,韩博,等.中药有效成分对脑胶质瘤治疗的机制研究进展[J].中华神经外科疾病研究杂志,2018,17(01):86-88.

[10] 马勇,王礼宁,郭杨,等.姜黄素通过调节Wnt/β-catenin信号通路促进软骨细胞增殖的研究[J].广州中医药大学学报,2017,34(1):90-95.

[11] Gao L, Chen B, Li J, et al. Wnt/β-catenin signaling pathway inhibits the proliferation and apoptosis of U87 glioma cells via different mechanisms[J]. PLoS One, 2017,12(8):e0181346.

[12] 赵轶峰,魏玉磊,王萍,等.姜黄素抑制Wnt/β-catenin信号通路诱导乳腺癌细胞凋亡的机制研究[J].现代中西医结合杂志,2016,25(29):3202-3204,3306.