间充质干细胞对VX2肺癌模型化疗所致肾损害的干预研究

时间:2019-11-18 11:11 来源:当代医学 作者:史岩,穆玉恕,沈艳霜

论著

 

 


(山东第一医科大学第二附属医院胸外科,山东  泰安  271000

资助项目: 山东省泰安市泰安科技计划基金资助项目(2016NS1169

 

摘要:目的  探讨间充质干细胞(MSCs)对VX2兔肺癌模型化疗所引起肾损害的防护作用,为临床应用提供实验依据。方法  选用3.03.5kg的新西兰大白兔随机分为空白对照组、单药化疗组、MSCs干预化疗组。利用CT定位的方法建立VX2兔肺癌模型,模型建立成功后第2周开始给予单药化疗组顺铂(1.8mg/kg),给予MSCs干预化疗组顺铂(1.8mg/kg)和MSCs1×106/只),每周1次,并观察实验兔肾功能、酸碱平衡以及电解质指标,经过3个周期的治疗,处死动物取肾做病理学检查。结果  单药化疗组和MSCs干预化疗组中的尿素氮、血肌酐及K+均呈升高趋势,然而MSCs干预化疗组中的血尿素氮、血肌酐及K+显著低于单药化疗组, 观察病理结果发现单药化疗组中兔肾组织出现肾小球血管充盈、少量中性粒细胞浸润、肾小管水肿及间充质充血,部分有局灶性出血;而MSCs干预化疗组的肾损害显著减轻,经方差分析,差异具有统计学意义(P0.05)。结论  MSCs具有保护化疗所致肾损害以及改善肾功能的作用。

关键词:间充质干细胞;化疗;肾损害;VX2瘤株

 

Intervention study of mesenchymal stem cells on VX2 lung cancer model of chemotherapy induced renal damage

Shi Yan, Mu Yushu, , ShenYanshuang

(Cardiothoracic Suegery, The Second Affiliated Hospital First Medical Universtiy, Taian, Shandong, 271000, China)

Abstract: Objective  Inquire into the MSCs intervention of kidney damage caused by chemotherapy that injection of VX2 lung cancer model in rabbits, Provide experimental basis for clinical application. Methods  Select the 3.0-3.5kg of New Zealand rabbits were divided into the control group,single agent chemotherapy group and MSCs intervention chemotherapy group.Utilization CT positioned method to establish VX2 lung cancer model in rabbits, Model building on two weeks after the success that giving single agent chemotherapy group of cisplatin (1.8mg/kg), giving MSCs intervention chemotherapy group of cisplatin (1.8mg/kg) and MSCs (1×106/only), one time a week and observe the rabbits kidney function pH balance and the electrolyte indicators, after three cycles of treatment, animals were sacrificed for histopathological check the kidney. Results  Single agent chemotherapy group and MSCs intervention chemotherapy group urea nitrogen, serum creatinine and K+ showed increasing tendency, but the MSCs intervention chemotherapy group urea nitrogen serum creatinine and K+ significantly lower than that single agent chemotherapy group, single agent chemotherapy group observe the pathological results showed in rabbit kidney tissue of the glomerular vascular filling, the small amount of neutrophil infiltration, renal tubular edema and mesenchymal hyperemia, portion has with focal of bleeding; MSCs intervention chemotherapy group and kidney damage significantly reduced. By analysis of variance statistical significance (P0.05). Conclusion  MSCs have a protective role of chemotherapy-induced kidney damage and improve the renal function.

Key words: Umbilical cord mesenchymal stem cells; Chemotherapy; Kidney damage; VX2 cell strain

 


根据世界卫生组织在中国调查报告指出,肺癌在我国发病率位列所有癌症之首[1],对于治疗肿瘤的方法有很多,化疗是其最重要的手段之一,由于化疗药物本身的毒性,临床上使用受到很大的限制。某种程度上化疗药物对患者本身的损害远大于其疗效,化疗药物毒性对肾脏的损害尤为明显。间充质干细胞(MSCs)具有多向分化潜能、免疫调控及自我复制等特性[2-3]。本实验通过利用对肾脏损害最大的顺铂作为研究药物,观察对VX2兔肺癌模型造成肾损害,并利用MSCs干预,对顺铂所致肾损害的治疗作用。

1  材料与方法

1.1  实验动物  健康的新西兰大白兔52只,体质量3.03.2kg,雌雄不限,由济南西岭角养殖繁育中心提供 [合格证号:SCXK(鲁):20100005],实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。

1.2  实验药物  MSCs由济南军区总医院干细胞研究中心赠送;兔间变表皮鳞癌瘤株(VX2)由东南大学实验室提供;注射用顺铂(冻干型,齐鲁制药厂,产品批号:3070012DC20mg/瓶)。尿素氮测定试剂盒(速率法),肌酐测定试剂盒(酶法)购自上海太阳生物技术有限公司。

1.3  实验仪器  Ichem-340全自动生化分析仪(山东博迈达生物科技有限公司),LGR16-W型台式高速冷冻离心机(北京京立离心机有限公司),普通显微镜及倒置显微镜均为日本Olympus公司产品。

1.4  实验方法

1.4.1  间充质干细胞(MSCs)制备  将冻存管从液氮中取出,迅速投至37的水浴箱中,缓慢摇动冻存管,使内容物尽快融化。将内容物完全融化的冻存管从37温水中取出,置于无菌超净工作台中乙醇消毒后开启,用吸管吸出冻存管内的细胞悬液,注入含有培养液的培养皿内,充分摇匀,待培养皿内的细胞悬液分布均匀后放置于5%CO237的培养箱中静置培养,次日更换培养皿内的培养液,继续进行培养。当培养皿中细胞长至80%时,及时消化收集细胞,吸去培养基,用PBS冲洗3遍,加入0.25%胰酶6ml使其覆盖全培养皿,静置5 min,待细胞形态变圆并且全部悬浮时加入1ml终止液终止消化;将细胞收集于50ml离心管中,1000r/min离心5 min,后弃掉上清液,加入适量的培养基,用10ml吸管轻轻吹打成单个细胞,如此反复离心5次,彻底清洗细胞,最后用0.9%氯化钠溶液调整细胞密度为1×106/ml,置于室温下备用。

1.4.2  动物模型建立  将所有新西兰大白兔随机分为对照组(A组)10只、单药化疗组(B组)21只和MSCs干预化疗组(C组)21只。将B组和C组的42只大白兔在CT定位下行右侧肺内接种VX2瘤株[4]。模型建立成功后第2周开始给予B组经耳缘静脉注射顺铂(1.8mg/kg),同样方法给予C组注射顺铂(1.8mg/kg)和MSCs1×106/只),1/周,连续注射3个周期。

1.4.3  血生化指标的检测  每次给药后禁食水12小时,经耳缘静脉取血1mL并分离出血清,使用全自动生化分析仪检测血清中的尿素氮、肌酐的浓度[5],电解质与酸碱平衡指标如K+Na+Cl+HCO3各浓度。

1.4.4  肾脏的病理检查  A组、B组和C组的所有大白兔处死并取出肾脏用20%的甲醛溶液固定,制作成病理切片行HE染色,观察染色后肾脏的病理变化[6]

1.5  统计学方法  所有实验数据经标准化处理后,采用SPSS 19.0统计软件分析数据,实验动物血液指标均采用注射药物前后自身对照,做配对t检验;以P0.05表示差异具有统计学意义。

2  结果

2.1  影像学检查  接种VX2瘤株1周后通过CT平扫发现B组及C组中的大白兔右下肺出现椭圆形或不规则形高密度影,边缘欠清,VX2兔肺癌模型建立成功,见图1

VX2种植后第3周的CT影像

Figure 1  CT images of VX2 implants at the 3rd week after implantation

2.2  VX2兔肺癌模型的肾功能、电解质及酸碱平衡的变化  经过3个周期的治疗,B组与C组中分别有2只(9.52%)和1只(4.76%)实验兔死亡, 3VX2兔肺癌模型的肾功能、电解质及酸碱平衡指标结果见表13、见图2。由此可见,B组中血肌酐、尿素氮及K+均呈上升趋势(P0.05),血液中的HCO3浓度呈下降趋势(P0.05),而C组中血肌酐、尿素氮及K+的含量显著低于B组。3VX2兔肺癌模型中的血Na+Cl+含量改变差异均无统计学意义。

 


1  A组注射生理盐水后血液指标变化n=10χ()±s

Tbale 1  Changes of blood parameters after cisplatin plus MSCs injection in group A (n=21χ()±s)

采血时间

血肌酐

μmol/L

尿素氮

mmol/L

HCO3

mmol/L

K+

mmol/L

Na+

mmol/L

Cl

mmol/L

0

75.6±13.5

5.4±1.5

21.9±2.3

4.0±1.3

141.5±4.2

99.5±5.1

1

80.7±12.2

6.3±2.0

23.1±2.8

3.9±0.5

139.7±3.8

101.5±4.7

2

81.5±11.5

4.9±1.8

22.7±2.1a

3.5±0.5

144.5±3.7

102.4±4.2

3

79.3±12.7a

5.1±2.3a

21.8±3.0a

3.7±1.1a

141.9±3.8

101.3±3.9

注:0周比较, aP0.05

2  B组注射顺铂后血液指标变化(n=21χ()±s

Table 2  Changes of blood parameters after cisplatin plus MSCs injection in group B (n=21χ()±s)

采血时间

血肌酐

μmol/L

尿素氮

mmol/L

HCO3

mmol/L

K+

mmol/L

Na+

mmol/L

Cl

mmol/L

0

81.8±13.1

6.6±2.0

25.4±3.1

4.2±1.5

138.5±3.6

101.2±4.6

1

189.1±21.2a

8.6±1.5a

19.1±1.9a  

6.5±2.1a

142.7±4.1

99.7±5.4

2

254.4±35.5a

11.1±2.3a

17.7±3.1a

7.6±1.7a

143.5±2.9

103.6±4.4

3

310.4±31.1a

18.5±2.9a

15.6±2.8a

8.4±1.2a

139.9±3.3

101.5±5.2

注:0周比较, aP0.05

3  C组注射顺铂加MSCs后血液指标变化(n=21χ()±s

Table 3  Changes of blood parameters after cisplatin plus MSCs injection in group C (n=21χ()±s)_

采血时间

血肌酐

μmol/L

尿素氮

mmol/L

HCO3

mmol/L

K+

mmol/L

Na+

mmol/L

Cl

mmol/L

0

89.7±14.8

5.7±1.5

26.1±2.8

3.9±2.1

148.4±4.1

97.5±4.1

1

172.1±18.6a

7.6±2.5a

21.1±1.7a  

5.8±2.6a

141.4±5.0

100.7±4.6

2

181.4±25.4

9.1±1.6a

18.2±2.4a

6.7±1.5a

143.7±3.1

103.9±5.2

3

160.9±19.1a

10.1±2.4a

17.6±1.9a

7.2±2.4a

142.5±3.7

101.1±3.1

注:0周比较, aP0.05


 

 

2  MSCs对化疗3周期后大白兔尿素氮及血肌酐含量影响的对比

Figure 2  Comparison of effects of MSCs on urea nitrogen and serum creatinine in rabbits after 3 cycles of chemotherapy

注:BC组比较,aP0.05

2.2  肾脏的病理变化  肉眼观察B组的肾脏与A组相比略显苍白,而C组的肾脏与B组比较为更红润;HE染色镜下观察发现,A组肾脏内肾小体完整。B组肾脏可观察到肾小球血管充盈中性粒细胞增多、肾小管水肿及间充质充血。C组部分实验兔肾组织则出现不同程度的肾小管水肿及间充质充血(见3A组相比,B组兔肾脏病理切片在200倍镜下观察发现双侧肾的肾小管出现水肿,部分出现间充质充血;在400倍镜下观察发现部分肾小球管出现充血,其内伴有少量浸润的中性粒细胞,肾小管上皮细胞也出现不同程度的水肿,其管腔较正常肾小管狭窄,部分间充质出现充血,还有1例实验兔出现灶性出血。上述病理结果表明:B组兔的肾实质受到损伤主要表现于肾小管的间质(见图3)。同样的方法观察C组中的肾脏病理切片发现肾小管水肿及间充质出血以及肾小球充血的情况明显少于B组。

肾脏病理变化图

注:A/B正常兔肾小管 (×60);C1:肾小球血管充盈,中性粒细胞增多(×200),C2:肾小球血管充盈,中性粒细胞增多(×400);D1:肾小管水肿,间充质充血(×200),D2: 肾小管水肿,间充质充血(×400

 

 

讨论

血肌酐和尿素氮能够较为准确的反应肾功能指标,无外界因素的影响下,血肌酐和尿素氮可以反映出肾脏是否受损。本实验通过顺铂及MSCsVX2兔肺癌模型进行治疗并根据血肌酐及尿素氮的变化分析两组肾脏的损害情况[7-8]。结果发现:B组和C组中血肌酐和尿素氮含量均升高,表明顺铂已经对肾脏造成较为严重的损害,而C组中的血肌酐和尿素氮含量明显低于B组,这说明C组中的肾功能损害较B组轻,其原因可能与MSCs自我修复和归巢效应有关,这为将来应用于临床对肾脏的保护提供了实验数据。

通过分析B组和C组电解质的结果发现,B组中血HCO3含量减少,而K+的含量明显升高,Na+Cl+等其他电解质浓度无明显改变,出现这样的结果可能与肾功能的排酸保碱功能降低,从而造成代谢性酸中毒和高钾血症 [9-10]C组的K+的含量显著低于B组,此时,C组中兔尿液PH值明显低于B组,由于PH值增加属反常碱性尿,其原因考虑为高血K+引起肾小管分泌K+增加而分泌H+减少,这也反映出MSCs对肾实质组织具有保护作用。

本实验中B组在给予顺铂治疗后出现肾组织病理变化,即涉及肾小球改变又涉及肾小管变化甚至还出现灶性出血,这表明化疗药主要损害肾小管间质,这与临床上化疗药物毒性病理学表现基本一致[10-11]。但是C组中肾损害情况明显少于B组,说明MSCs能够防护因顺铂所致肾损害。其防护机制可以考虑为以下几点:①MSCs具有归巢效应,对受损的组织器官能主动寻找并进行修复;②MSCs经过血液运输到达肾脏,因其具有多项分化及自我复制的特点,在肾组织中起到修复作用;③当MSCs进入VX2兔肺癌模型体内时,化疗药物毒性可能被部分抵消,减少化疗药物毒性所致肾脏损害。

综上所述,采用VX2肿瘤组织块P407凝胶悬液法建立大白兔肺癌模型,操作简单,成功率高,尤其在CT定位下种植部位更加准确。顺铂是临床上常用的化疗药物,治疗肿瘤的作用切实可靠,但顺铂对肾伤害也非常明显。本研究通过采用MSCs对顺铂所致多器官损害的干预发现,MSCs对化疗所致肾功能损害具有减轻肾毒害作用。相信本研究的结果将在将来肿瘤化疗药物所引起多脏器损害领域中起到指引作用。

 

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