氧化乐果中毒致肺损伤大鼠血清TNF-α浓度与肺组织TNF-α表达相关性的实验研究

[摘要]  目的  探讨氧化乐果中毒致肺损伤大鼠血清TNF-α浓度与肺组织TNF-α表达与肺损伤程度的相关性以及TNF-α浓度与肺组织TNF-α表达的相关性。方法  90只健康雄性SD大鼠随机分为3组：空白对照组（A组）、染毒组（B组），A组30只，B组60只。B组大鼠氧化乐果灌胃染毒（45mg/kg），A组大鼠生理盐水灌胃作为空白对照。分别于染毒或生理盐水灌胃后30min、3h、6h、12h、24h、48h处死大鼠，测定各组肺系数、血清TNF-α浓度、肺组织TNF-α表达水平。结果  血清TNF-α浓度、肺组织TNF-α表达水平与肺系数呈正相关（г分别为0.93，0.91）；血清TNF-α浓度与肺组织TNF-α表达水平呈正相关（г=0.96）。结论  氧化乐果中毒致肺损伤大鼠血清TNF-α浓度及肺组织TNF-α水平与肺损伤程度呈正相关，TNF-α浓度与肺组织TNF-α水平呈正相关。
　　[关键词]  有机磷；中毒；肺损伤；肿瘤坏死因子-α

　　[Abstract]  Objective To explore the correlation between the blood serum tumor necrosis factor(TNF)- concentrations and severity of lung injury,TNF- level of lung tissue and severity of lung injury,the blood serum TNF- concentrations and TNF- level of lung tissue of folimat poisoning-induced lung injury in rat.Methods Ninety healthy male SD rats were randomly divided into three groups:group A(control,30 rats),group B(omethoate gavage exposure,60 rats).All the rats in group B were treated omethoate by gavage(45mg/kg).Rats in group A were treated normal saline by gavage.Then killed the rats at designated observing point,determine the lung coefficient,blood serum TNF- concentration and TNF- level of lung tissue.Results The existing correlation ()between serum TNF- concentration and lung coefficient,TNF- level of lung tissue and lung coefficient was 0.93,0.91 respectively,and the correlation ()between serum TNF- concentration and TNF- level of lung tissue was 0.96.Conclusion Lung injury of rats induced by omethoate poisoning show positive correlation between serum TNF- concentration and TNF- level of lung tissue,between serum TNF- concentration,TNF- level of lung tissue and lung coefficient.
　　[Key word]  Organophosphate;Poisoning;Lung injury;Tumor necrosis factor-

　　在发展中国家，急性有机磷杀虫药中毒（acute organ phosp-horous pesticide poisoning，AOPP）是急诊科常见的急危重症之一[1]。重症患者常因肺水肿、脑水肿、呼吸循环衰竭死亡。据统计，我国1995年AOPP患者的病死率高达12.8%。AOPP患者常并发肺损伤，肺水肿是重度AOPP患者最常见的并发症[2]。AOPP所致肺水肿早期主要表现为肺间质水肿，若继续发展可进展为肺泡性肺水肿，终末期患者可因中枢性呼吸抑制、呼吸循环衰竭或多脏器衰竭而死亡，呼吸肌麻痹和肺水肿也可能为致死的主要原因[3]。TNF-α是最重要的炎症因子之一，血清TNF-α浓度及测量方法简便，本实验研究目的为证实血清TNF-α浓度是否能间接反映肺组织TNF-α水平及肺损伤程度。

　　1  材料与方法
　　1.1  建立动物模型
　　选择健康雄性SD大鼠（6周龄）150只，体重200～250g，随机分成三组，A组为对照组，B组为染毒组。A组大鼠30只，B组60只。A组灌胃注射无菌生理盐水，将B组以0.4％氧化乐果乳油工作液以45mg/kg灌胃染毒建立AOPP模型。以出现流涎、肌颤、呼吸困难、步态不稳为标准选择AOPP模型，剔除中毒症状不明显以及死亡的个体。将实验过程分为染毒后或生理盐水30min、3h、6h、12h、24h、48h 6个观察时点。
　　1.2  留取标本
　　在对应时间点分别于各组中随机抽取5只大鼠，用颈椎脱臼法处死后摘取眼球放血，4℃静置3h自然凝固，然后高速冷冻离心机5000rmp离心5min小心取上层血清放至-80℃冰箱内备用；打开胸腔取出肺脏，用生理盐水冲去表面血迹并用滤纸擦干并称重，将双肺分别用10%甲醛固定后脱水、包埋、切片。
　　1.3  肺系数测定
　　用公式肺湿重/体重×100%测定肺系数。将双肺分别用10%甲醛固定后脱水、包埋、切片，左肺组织HE染色观察肺泡及肺间质形态变化，右肺切片以免疫组化染色后在200倍光镜下拍照，用图像处理软件IPP6.0处理图片计算光密度值，光密度值与TNF-α水平成正相关。用光密度值代表肺组织TNF-α水平。用ELISA法测定血清TNF-α浓度。
　　1.4  统计方法
　　所有计量资料均采用SPSS11.5统计软件分析，用相关回归分析A、B两组大鼠的血清TNF-α浓度、肺TNF-α水平与肺系数相关性，血清TNF-α浓度与肺TNF-α水平相关性。

　　2  结果
　　2.1  实验过程中大鼠的反应及死亡数量
　　A组大鼠在实验过程中无异常反应，除处死对象外无死亡个体。B组大鼠在氧化乐果灌胃后10min均出现有机磷杀虫剂中毒症状：流涎、肌肉震颤、步态不稳、呼吸急促、腹泻，症状于6h达高峰，12h后逐渐减轻，24h后症状消失。除处死个体外，B组大鼠死亡数为29只。
　　2.2  肺组织病理学改变
　　A组大鼠各时间点肺组织切片均正常。B组大鼠肺组织于染毒后30min～6h出现逐渐加重的肺间质充血、肺泡间隔增宽，局部可见肺泡内红细胞聚集。12～48h上述变化逐渐减轻，但仍未恢复至正常。
　　2.3  血清与肺组织TNF-α表达以及肺系数的变化
　　对大鼠肺组织切片免疫组化结果进行分析，TNF-α表达的部位即图片中棕黄色物质的部分，主要位于肺间质细胞质中，部分细胞核也有表达。肺组织TNF-α水平越高，照片中棕黄色部分着色越深。用图像处理软件IPP6.0处理图片计算光密度值，光密度值与TNF-α水平呈正相关。因此，用光密度值代表肺组织TNF-α水平。血清TNF-α浓度及肺系数变化见表1。
　　表1  大鼠血清TNF-α浓度、肺组织TNF-α水平及肺系数

　　2.4  TNF-α表达与肺系数相关性
　　血清TNF-α浓度与肺系数，肺组织TNF-α水平与肺系数，血清TNF-α浓度与肺组织TNF-α水平均呈正相关（相关系数r分别为0.93，0.91，0.96）。

　　3  讨论
　　AOPP在农药中毒中发病率最高，重症患者合并多器官功能衰竭的发病率、死亡率高，肺往往是最先受累的器官。有机磷杀虫剂进入机体作为一种强烈的应激原使机体产生一系列应激反应，刺激免疫系统释放大量细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6，一旦水平异常增高则会损伤机体正常组织。TNF-α是早期主要的前炎症因子之一，在内毒素血症试验中，提前中和TNF-α的活性可阻断其他细胞因子释放[4]。
　　本实验以氧化乐果灌胃染毒制造AOPP致肺损伤模型，灌胃后染毒大鼠出现毒蕈碱样症状及烟碱样症状。染毒大鼠肺系数增大、肺组织HE染色发现肺泡间隔增宽、肺泡内红细胞聚集及血清TNF-α浓度的增高，模型复制成功。本实验结果发现血清TNF-α浓度、肺组织TNF-α水平与肺系数呈正相关，血清TNF-α浓度与肺组织TNF-α水平呈正相关，说明血清TNF-α浓度可间接反映肺组织TNF-α水平以及肺损伤严重程度。
　　临床中有大量有机磷中毒并发肺损伤患者，由于难以获取标本，通过肺组织检查如病理学检验、免疫组化确定患者肺损伤的程度不现实。血清TNF-α浓度与肺组织TNF-α水平及肺损伤程度有良好的相关性，并且患者的血液标本容易采集，因此可用血清TNF-α浓度来间接反映肺组织TNF-α水平及肺损伤的程度，从而为临床上以血清TNF-α浓度评估有机磷中毒致肺损伤严重程度提供理论依据。

　　参考文献
　　[1]  王巧珍.69例急性有机磷农药中毒的急救与护理体会[J].当代医学，2010，16（21）:120-121.
　　[2]  叶传勇，陈佳山，蒋炜，等.597例急性有机磷农药中毒并发症的临床分析及抢救体会[J].中国危重病急救医学，2001，13（6）：373-374.
　　[3]  于润江.中国内科专家经验文集[M].沈阳：沈阳出版社，1993：923-933.
　　[4]  Suffredini AF，Reda D，Bands SM，et al.Effects of recombinant diametric TNF receptor on inflammatory responses following intravenous antitoxin administration[J].J Immunol，1995，155（10）：5038-5045.