血管内皮细胞生长因子在胃癌中的表达及其临床意义

　　[摘要]目的研究血管生长因子(VEGF)在胃癌发生、发展中的作用。方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及计算机条带分析半定量方法检测
VEGF在56例胃癌组织及相应癌周组织的表达水平。结果<0.05)； P，()16/30(％高于癌边组织中表达阳性率53.3(49/56)，％①胃癌中VEGF阳性表达率为87.75②胃癌中VEGF阳性表达率在不同分化程度组比较无显著性差异( P>0.05)。结论VEGF在胃癌中高表达，提示其可能与胃癌的恶性进展有关，检测VEGF在胃癌中的表达对判断胃癌的恶性程度有价值。

　　[关键词]血管内皮生因子；胃癌；血管生成
　　[Abstract] Objective This study was to evaluate the relationship between VEGF expression and gastric cancer. Methods The expression of VEGF mRNA in 56 gastric carcinoma was examined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Results VEGF was found in cytoplastic and cell surface of most gastric carcinoma cell (positive staining 49 in 56), the rate of positive staining in gastric carcinoma was the highest(P<0.05). Conclusion The expression of VEGF was high in gastric cancer,which indicate that high expression of VEGF may correlate with the malignancy of gastric cancer.
　　[Key words] Vascular endothelial growth factor; Gastric cancer; Angiogenesis

　　胃癌是常见的恶性肿瘤之一，根据世界卫生组织公布的数据,胃癌是世界范围内发病率居第四位的恶性肿瘤，每年新发病例达87万，虽然近十年西方国家的发病率逐年下降，但是其致死亡率仍居恶性肿瘤的第二位，仅次于肺癌，是全球公共健康的巨大威胁 [1]。据我国1990～2000年10年的抽样人口死因回顾调查资料显示，我国胃癌的死亡率为25.53/10万，每年死亡31.1万人，占癌症总死亡的23.93％，每年死于胃癌的患者居恶性肿瘤死亡原因的首位。随着胃癌研究的深入，众多研究表明 [2]，血管生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)在胃癌发生、发展过程中起到重要作用。VEGF又称血管通透因子，在正常组织及多种肿瘤中均有表达，它具有促进血管内皮细胞增殖、迁移及诱导血管生成，促进微静脉、小静脉通透性增加，在肿瘤生长及转移等生理、病理过程中起重要作用，因此研究在胃癌中的表达可能为胃癌的防治提供新的思路。

　　1　材料与方法
　　1.1　研究对象
　　选取2009～2010年在我院肿瘤科手术切除胃癌标本56例，术前所有患者没有接受过放疗和/或化疗和/或激素治疗，患者均有完整的病理资料。其中男32例，女24例，年龄33～86岁，中位年龄60岁。经病理医师证实均为进展期胃腺癌，其中高分化腺癌12例，中分化腺癌18例，低分化腺癌26例。分别另取30例距癌组织2cm处的癌旁组织和30例切缘正常组织作为对照。术后立即取材，部分组织用4％中性福尔马林固定，其它组织放入无RNA酶冷冻管中，置液氮中或冰壶中速冻，-80℃保存备用。
　　1.2　方法

　　1.2.1　主要试剂

　　组织RNA提取试剂盒购自北京艾比根生物技术有限公司； RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；DNA Marker及引物由上海生工公司提供。VEGF及内参照β-actin引物序列如下：
VEGF P1：ATGGCAGAAGGAGGAGGG； VEGF P2：CGAAACGCTGAGGGAGGCT； β-actin P1：CTATTGGCAACGAGCGGTTC； β-actin

P2：CTTAGGAGTGGGGGTGGCTT。
　　1.2.2　组织中总RNA抽取及鉴定　按试剂盒说明抽提标本中的总mRNA,首先加入一定量的Trizol试剂，然后匀浆，沉淀RNA后，加入适量的DEPC处理水溶解RNA，立即电泳和紫外浓度和纯度鉴定，剩余-20℃保存备用。
　　1.2.3　RT-PCR扩增VEGF
① VEGF反应体系： MgCl2，4μL；10×RNA PCR Buffer，2μL；RNase Free dH2O，8.5μL；dNTP混合物，2μL；RNaseInhibitor，0.5μL；AMV ReverseTranscriPtase，1μL； Random9mers，1μL；RNA样品2μL，总反应体系20μL；②VEGF反应条件：反转录反应45℃ 30min；AMV反转录酶灭活和RNA/cDNA引物变性96℃ 3min；cDNA第2链合成及PCR扩增:变性94℃ 2min，退火58℃1min,延伸72℃ 2min,共32个循环，最后延伸72℃ 10min。
　　1.2.4　PCR产物电泳
　　取PCR产物4μL，加1μL6×加样缓冲液，混合均匀后加至凝胶加样孔中；同时加入DNA分子量标准(Marker)作参照，按4V/cm稳压电泳30min。
　　1.2.5　统计学方法
　　采用SPSS15.0统计软件进行数据分析，两两比较用独立样本 t检验，多个独立样本比较的Kruskal-WallisH检验。以α =0.05为检验标准进行统计分析。

　　2　结果
　　2.1　VEGF基因的RT-PCR扩增
分别以提取的组织总RNA为模板，用特异性引物，通过 RT-PC方法扩增VEGF基因片段，1.5％的琼脂糖凝胶电泳结果显示(图1)：PCR扩增出了位于核酸标准分子420bP及750bP左右有两条DNA片段，与预期VEGF、 β-actin基因片段大小相符。

图1.VEGFmRNA的表达.1、2:胃癌组织；3、4：癌边组织；5：对照组
　　2.2　VEGF在正常组、癌旁组、胃癌组中的表达RT-PCR检测的56例胃癌组织中，V EGF表达阳性率为
87.5％(49/56)；30例癌边组织中表达阳性率为53.3％(16/30)；30例癌边组织中表达阳性率为26.7％(8/30)；三组之间相比有显著性差异(H=41.162， P<0.01)，两两比较详见表1。RT-PCR灰度扫描结果表明：正常组、癌旁组、癌组的灰度比分别0.12、0.76、1.51，其中胃癌组中VEGFmRNA表达水平最高。
表1.不同实验组中VEGF表达情况
分组 例数 (n) 表达阳性率 (％)  P
正常组  30 26.7％ (8/30)  0.038a
癌旁组  30  53.3％(16/30)  0.016b
胃癌组  56 87.5％ (49/56)  0.009c

注：a:正常对照组VS癌旁组；b：癌旁组VS胃癌组；c：正常对照组VS胃癌组
　　2.3　VEGF在不同分化程度的胃癌组织中的表达
研究结果显示VEGF在高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌组中表达的阳性率分别为92.3％(24/26)、88.9％(16/18)、
83.3％(10/12)，经组间两两比较，均无显著性差异( P>0.05)。

　　3　讨论
　　VEGF是众所周知的血管生成因子，它能特异性地作用于血管内皮细胞的有丝分裂原，通过与其受体KDR结合，产生生物学效应，促进血管生成和肿瘤浸润转移。VEGF在各种肿瘤中均有不同程度的表达，主要分布于肿瘤与正常组织的交界区域，而该处新生血管丰富，表明了VEGF对肿瘤的作用。有研究报道VEGF在胃癌中高表达，但其在胃癌中表达阳性率等尚不清楚。本研究在进一步明确了VEGF在胃癌及癌旁组组织的分泌情况， RT-PCR检测结果发现胃癌中VEGF表达较高(87.5％,49/56)，高于癌旁组织对正常对照组( P<0.05)，与先前Yonemura [3]和White [4]的研究结果一致，提示胃癌中可以分泌VEGF，VEGF的过表达增加肿瘤边缘淋巴管的表面积，使肿瘤细胞入侵机会增加，肿瘤周边的功能性淋巴管可促进肿瘤转移。
　　本研究还发现VEGF的表达在不同分化程度的胃癌组织中表达无显著性差异( P>0.05)，与孙萍萍研究结果基本一致 [5]。然而，也有研究报道 [6]高分化型胃癌VEGF表达水平明显低于分化组，血清VEGF水平与肿瘤分期、肿瘤细胞浸润程度及远处转移发生率呈正相关，而接受了原发灶根治性切除术的胃癌患者，术后其血清VEGF水平明显下降。因此，检验VEGF表达水平可否作为独立预后因子和敏感的胃癌转移的指标还需进一步研究。
　　总之，我们认为VEGF积极参与了胃癌的新生血管增殖过程，与胃癌的发生、发展密切相关，为进一步阐明VEGF在胃癌恶
性进展中的作用及机制以及为胃癌治疗开辟新的途径。

　　参考文献
　　[1]　刘超,王立.VEGF家族及其与胃癌关系的研究进展[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2006,13(5):393-395.

　　[2]　Jussila L,Alitalo K.Vascular growth factors and lymPhangiogenesis[J].Physiol Rev,2002,82(3):673-700.

　　[3]　Yonemura Y,Fushida S,Bando E,et al.LymPhangiogenesis and the vascular endothelial growth factor recePtor(VEGFR)23 in gastric cancer[J].Eur J Cancer,2001,37(7):918-923.

　　[4]　White JD,Hewett PW,Kosuge D,et al.Vascular endothelial growth factor 2D expression is an indendent Prognostic marker for survival in colorectal carcinoma[J].Cancer Research,2002,62(6):1665-1669.

　　[5]　孙萍萍.D2-40、VEGF-C、VEGF-D和CD44(v6)、nm23在胃癌中的表达及其生物学意义[D].河北医科大学, 2007.

　　[6]　Karayiannakis AJ,Syrigos KN,Polychronidis A,et al.Circulating VEGF levels in the serum of gastric cancer Patients:correlation with Pathological variables,Patient survival,and tumor surgery[J].Ann Surg, 2002,236(1):37-42.