姜黄素对大鼠肺缺血-再灌注损伤的保护作用

[摘要]  目的  探讨姜黄素对肺再灌注损伤保护作用的机制。方法  36只SD大鼠随机分为假手术对照(S组，n=12)组、缺血-再灌注 (I/R组，n=12)组、姜黄素+缺血/再灌注 (CUR组，n=12)组。观察大鼠单侧肺缺血1h再灌注1h后肺组织NF-KB的表达变化,肺细胞凋亡情况。结果  ①I/R组NF-KB的IOD值显著增加，明显高于S组，而CUR组NF-KB的IOD值较I/R组减少(P＜0.05)；②缺血-再灌注后I/R组凋亡的阳性细胞数显著增加，高于S组，而CUR组凋亡的阳性细胞数较I/R组减少(P＜0.05)。结论  姜黄素对肺再灌注所致肺细胞凋亡有保护作用，其机制可能与降低NF-KB的活化有关。
　　[关键词]   肺；再灌注损伤；凋亡；NF-KB；姜黄素

　　[Abstract]  Objective To investigate the mechanism that curcumin on the protective effects of lung reperfusion injury. Methods 36 SD rats were randomly divided into sham operation (S group, n = 12) group, ischemia - reperfusion (I / R group, n = 12) group, and curcumin + ischemia / reperfusion (CUR group, n = 12) groups. To observe the expression of NF-KB in lung tissue and the lung cell apoptosis after Unilateral rat lung ischemia-reperfusion 1 hour. Results ①The IOD value of NF-KB in I / R group significantly higher than it in the S group, while the IOD value of NF-KB in CUR group lower than it in the I / R group (P<0.05); ②The number of apoptosis-positive cells in I / R group ncreased significantly after ischemia - reperfusion ,which more than the S group, while the number of apoptosis-positive cells in CUR group less than it in I / R group (P<0.05). Conclusion Curcumin can protect lung cell to apoptosis when lung reperfusion, which may be associated with decreased activation of NF-KB.
　　[Key words]  Lung; Reperfusion injury; Apoptosis; NF-KB; Curcumin

　　良好的血液循环是组织细胞保持正常生理功能的基本条件，各种原因造成的组织血液灌流量减少会使细胞发生缺血性损伤，及早恢复血液供应可以明显减少细胞损伤。肺缺血-再灌注损伤(Lung Ischemia Reperfusion Injury，LIRI)过程中细胞凋亡过度可导致肺损伤，凋亡作为LIRI的早期事件，参与了LIRI的病理过程[1]。核转录因子-KB(NF-KB)具有启动基因转录的功能，它调节的转录产物是肺I／R损伤炎症反应的主要炎症介质和细胞因子，其中涉及效应细胞的激活及各效应分子的分泌、释放。姜黄素(curcumin，CUR)是姜科植物姜黄(curcuma longa)的地下根茎中分离出的主要活性物质，常用于色素和多种食物的调味添加剂，具有广泛的生物活性如抗炎、抗氧化、清除自由基、抗细胞凋亡、抑制缺血再灌注后的损伤等[2]。本实验通过建立大鼠单侧肺I/R动物模型，研究CUR对在体I/R后肺组织NF-KB、细胞凋亡表达的影响，并探讨CUR对肺I/R保护作用的可能机制。

　　1 材料与方法
　　1.1  动物及分组清洁级雄性SD大鼠(由四川大学华西医学中心提供)36只。体重250～350g。随机分为3组，每组12只，分别为假手术组(S组)、肺缺血再灌注组(I/R组)和姜黄素+缺血/再灌注组(CUR +I/R组)。各组间大鼠的体重及鼠龄无统计学差异。细胞凋亡检测采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)。TUNEL试剂盒、NF-KB免疫组化SABC过氧化物酶试剂盒以及Ⅰ抗抗体均为武汉博士德生物工程有限公司产品；CUR为贵阳信帮制药股份有限公司提供。
　　1.2  建立肺I/R模型  3％戊巴比妥(1mL/kg)腹腔注射麻醉后，气管切开插管，接动物呼吸机(f 80次／min，VT 30ml／kg，FiO2 21％)，参照Eppinger等[2]大鼠肺I/R模型加以改进，取左侧第4肋间前外侧切口入胸，分离肌层，剪开胸膜，S组于左肺门处以弯眼科镊引导7号指示线从下方绕过肺门，不予钳夹，于1h后取肺组织；I/R组于留置指示线外侧用无创伤微血管钳钳夹肺门远心脏一端，阻断肺门(包括血管和气管)1h(以肺无舒缩为阻断标准)，再开放1h(以肺恢复舒缩为标准)后取肺组织；EGB+I/R组于阻断肺门前30min腹腔注射CUR (10ml/kg)，S组、I/R组注射等量生理盐水。每只大鼠于阻断肺门前均腹腔注射肝素50U0，待5min肝素化后再阻断肺门。
　　1.3  检测指标及方法
　　1.3.1  肺组织NF-KB的表达  常规SABC法进行免疫组化检测，DAB染色，以PBS取代一抗和二抗作为空白对照，所用的Ⅰ抗NF-KB的浓度均为1:150。应用Image pro-plus图像分析软件计算每个视野(每张切片在ca3区随机取3个视野，取平均值)阳性细胞的积分光密度(IOD)。
　　1.3.2  TUNEL法检测肺组织细胞凋亡  操作按试剂盒说明书进行。阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)替代末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)。3，3-二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染。在光学显微镜下观察，细胞核中有棕黄色着色者为凋亡细胞。随机测定5个高倍镜视野(×400)下细胞凋亡数，计算细胞凋亡指数(AI)。AI=凋亡细胞数/总细胞数×100％。
　　1.4  统计学分析  数据以均数±标准差(x±s)表示。用SPSS13.0软件进行统计学分析。各组间均数应用方差分析检验方差齐性，方差齐者进行比较，组间两两比较采用成组t检验。检验标准以P≤0.05为具有统计学意义。

　　2 结果
　　2.1  NF-KB免疫组化结果  NF-KB的免疫组化染色多在胞浆或胞核(以胞核或胞质出现棕黄色为阳性染色)，S组中以NF-KB阳性神经元数很少，免疫反应产物的染色强度较弱，多为胞浆着色(P<0.05)；I/R组的NF-KB的阳性免疫反应产物的染色强度深高于S组、EGB+I/R组，此时，多为胞核着色，主要以肺泡上皮细胞和血管内皮细胞为主(P<0.05)；CUR+I/R组NF-KB的阳性免疫反应产物的染色强度低于I/R组(P<0.05)(见表1，图1～图3)。
　　2.2  肺组织细胞凋亡检测  I/R组、CUR+I/R组肺组织细胞AI值均明显高于S组(P≤0.05)；而与I/R组相比，CUR+I/R组的AI值显著降低(P≤0.05)。TUNEL染色阳性细胞主要见于肺血管内皮细胞、肺泡上皮细胞及少数炎性细胞(见表1、图4～图6)。 

表1  各组大鼠的AI值、NF-KB的IOD值

组别	NF-KB  IOD值	AI值（%）
S组	11.21±1.25	3.51±0.46
I/R组	30.01±3.16■	25.32±2.16■
CUR组	21.03±0.81▲	11.49±1.33▲

注：^■与S组比较，P<0.05；^▲与I/R组比较，P<0.05

　　3  讨论
　　肺缺血再灌注损伤(LIRI)是引起早期肺功能障碍的重要原因。近年来,有关急性肺损伤及细胞因子的许多研究深化了对肺缺血再灌注损伤发病机制的认识[3]。随着肺移植、体外循环以及肺外科中单侧肺循环阻断技术的广泛应用,肺缺血再灌注损伤对于术后肺功能的影响日益受到关注。术中因肺缺血而引起的肺组织坏死一直被认为是影响肺功能的最重要原因,然而近年的研究表明细胞凋亡在肺缺血再灌注损伤中的机制成为研究热点。
　　细胞凋亡又称细胞程序性死亡。在形态学上表现为细胞核固缩、染色体浓集以及DNA断裂,而细胞膜及细胞器保持相对的完整性。细胞凋亡在维持组织结构稳定、平衡细胞增殖与死亡中起重要作用。大量的研究表明缺血/再灌注不仅产生组织坏死，还出现细胞凋亡[4]。本研究显示对照组肺组织偶见凋亡细胞，而缺血再灌注各组出现大量的细胞凋亡，其中肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞最为明显，且随再灌注时间延长逐渐增多，与TUNEL 法所示时相一致，表明肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞凋亡可能在肺缺血再灌注损伤的发生中起着重要作用。
　　缺血再灌注期间,随着再灌注时间的延长逐渐出现肺功能降低。再灌注后NF-kB蛋白和mRNA表达明显增加,表明存在NF-kB的激活。它的激活在各种细胞外刺激信号转导调控中起核心作用。活化的NF-kB能与DNA链的特定B序列结合,启动和调节众多与免疫和炎症反应有关的基因转录, 包括前炎因子TNF-kb,IL-1,IL-6,IL-8以及使白细胞聚集的炎症介质和黏附分子。NF-kB激活导致上述介质的生成增加,加重了缺血再灌注。NF-kB抑制剂可以阻断NF-kB的生成和激活, 保护肺功能[5]。在离体大鼠肺I/R模型中发现NF-KB的活性在缺血期呈现基础水平，但再灌注30min后即明显增强。应用蛋白激酶C抑制剂及蛋白激酶C基因敲除鼠，均可提高LIRI动物的生存率，减轻中性粒细胞的聚集，而这一保护作用与其抑制NF-KB的活性有关[6]。因此，抑制NF-KB为抗炎药重要的作用靶点。我们的实验进一步证实上述的结果，NF-KB在S组有一定量的基础表达，且多为胞浆着色；与S组相比，I/R组的染色强度显著增加(P<0.05)，随着损伤程度的加重，多转为胞核着色。说明NF-KB在LIRI中起着重要的作用，抑制其活性能减轻肺的再灌注损伤。
　　姜黄素(curcumin)是一种酚性色素，是姜科植物姜黄(Curcuma longa)的地下根茎中分离出的主要活性物质，常用于色素和多种食物的调味添加剂，具有广泛的生物活性如抗炎、抗氧化、抗诱变，降血脂及抗动脉粥样硬化，抗肿瘤等等。近年来，姜黄素对缺血再灌注损伤的保护作用成为国内外研究的热点，其对缺血再灌注后的细胞凋亡、肺纤维化等保护作用日益受到重视，马艳等[7]认为姜黄素能够显著减少缺血性神经细胞凋亡的发生, 可能与保护线粒体功能, 减少AIF和Cytc的释放有关。姜黄素甚至深入到了分子生物学水平，现代分子生物学的各种技术和研究思路正在充分地应用到这一过程中。
　　本实验结果LIRI中，I/R组肺组织细胞凋亡大量发生。对大鼠进行CUR预处理可以大幅度减低缺血再灌注损伤后NF-KB的表达，并减少缺血再灌注损伤中的细胞凋亡现现象，表明EGb有抗缺血再灌注损伤的作用。通过实验及联系EGb药理作用，可见，EGb保护LIRI的机制可能为抗氧化及减少凋亡为其主要作用方式，并可能与NF-KB的表达有关。

　　参考文献
　　[1] 冯东杰,徐林.凋亡在肺缺血再灌注损伤中作用机制的研究进展[J].医学研究生学报,2010,2(23):214-217.
　　[2] Strimpakos AS, Sharma RA.Curcumin:preventive and therapeutic properties in laboratory studies and clinical trials[J].Antioxid Redox Signal, 2008,10(3): 511 -545.
　　[3] 刘冰,赵卉,牛攀霞,等.八肽胆囊收缩素对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用[J].当代医学,2009,15(9):91-92.
　　[4] Fischer S,de Perrot M,Liu M, et al.Interleuk in 10 gene transfect ion of donor lungs ameliorates posttransplant cell death by a switch from cellular necrosis to apoptosis[J].J Thorac Cardiovasc Surg,2003,126(4): 1174 -1180.
　　[5] Azzolina A, Bongiovanni A, Lampiasi N.Substance P induces TNF-alpha and IL-6 production through NF kappa Binperit on ealmast cells[J].Biochim Biophys Acta, 2003, 1643(1-3) :75-83.
　　[6] Ishii M,Suzuki Y,Takeshita K,et a1.Inhibition of C-Jun NH2-terminal kinase activity improves ischemia/reperfusion injury in rat lungs[J].J Immunol,2004,172(4):2569-2577.
　　[7] 马艳.姜黄素对缺血/再灌注大鼠神经细胞凋亡的影响[J].药物分析杂志,2010, 30 (7) :1233-1236.