乌鲁木齐成人麻疹病毒基因特征分析

[摘要]  目的  分析新疆乌鲁木齐市2008年成人麻疹爆发流行的麻疹野病毒的基因特征。方法  用Vero／slam细胞从成人麻疹暴发患者的标本中分离出麻疹野病毒，应用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)对麻疹野病毒分离株扩增核蛋白N基因羧基末端676个核苷酸片段，再对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析。并以N基因羧基末端450个核苷酸片段构建基因亲缘性关系树，进行核苷酸变异分析。结果  首批共分离到5株麻疹野病毒，这些病毒N基因450个核苷酸之间的差异为0%～0.2%，均为H1基因型中的Hla基因亚型。结论  引起新疆乌鲁木齐市2008年成人麻疹流行的麻疹野病毒为Hla基因亚型。
　　[关键词]  麻疹病毒；序列测定和分析；H1基因型

　　麻诊病毒属于副粘病毒科，麻疹病毒属。麻疹病毒只有一个血清型，但有多个基因型。截至2008年，全球已发现有8个组(A—H)，共23个基因型正在或曾在世界各地的人群中流行[1-2]。在麻疹病毒的基因组中，核蛋白(nucleoprotein,N)基因和血凝素(hemagglutinin，HA)基因是变异较大的基因，特别是N基因羧基(COOH)末端450个核苷酸是麻疹病毒基因组中变异最大的区域。WHO规定这450个核苷酸是鉴定基因型别所需的最少的靶序列，扩增并测定此基因片段，并与WHO参考株的序列做比较，以鉴定基因型，有助于鉴定麻疹病毒的来源和传播路线[1]。
　　虽然国内外对麻疹病毒分离株的基因特征、遗传变异方面的研究较多，但特别是新疆流行的麻疹基因型别和基因特征报道较少，自2003年以来新疆未见到类似的报道。本文针对2008年新疆成人麻疹爆发中分离的5份麻疹病毒株进行基因特征分析，报道如下。

　　1  材料与方法
　　1.1  标本来源  标本主要来源于2008新疆自治区人民医院收住的31例成人麻疹病人，在患者出诊第0～5d时采集咽拭子标本。咽拭子标本的采集和处理方法参照麻疹监测方案，简述如下：咽拭子保存在2ml麻疹病毒标本运输液中(含有2%牛血清和终浓度含青霉素1000U/ml、链霉素1000μg/ml、制霉菌素25U/ml的细胞培养液中)，-70℃保存备用。
　　1.2  麻疹病毒分离  使用世界卫生组织(WHO)推荐的Vero／SLAM细胞(非洲绿猴肾细胞／淋巴信号激活因子转染的非洲绿猴肾细胞)进行病毒分离，吸取上述处理后的咽拭子标本0.5ml接种75%单层覆盖的Vero／SLAM细胞，吸附lh后，弃上清，换含2%牛血清的细胞维持液，每天观察细胞液pH值和细胞病变(CytopathicEffect，CPE)，75%～90%CPE时收冻。
　　1.3  核酸提取和RT-PCR  使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN，Cbi na)试剂盒提取病毒悬液中的病毒核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)，具体方法参照说明书。使用RT-PCR对阳性毒株编码N蛋白羧基末端的676个核苷酸(bp)片段进行扩增，具体方法见文献[3]。
　　1.4  序列测定和分析  扩增后的PCR产物用QIA quick PCR purificatjon kit试剂盒纯化。然后分别使用上下游引物，用Big DyeTM  Terminator V3.0 Cycle Sequencing Ready react ion kit试剂盒进行双向标记反应，标记反应和随后的标记产物纯化参照文献方法[3]。纯化后的产物在Perkin E1mer公司ABI3100测序仪上，自动完成序列测定和校对分析。从序列测定仪上获得的序列资料以标准的图形文件(abl)保存，序列整理使用Seeunceher4.0.5软件(Gene Code，Ann Arbor，Michigan，USA)，将扩增的核苷酸片段序列截成所需的450个核苻酸片段。从基因数据库GenBank下载麻疹病毒代表株和中国使用的麻疹疫苗株，使用MEGA4.0软件对这些参考株和本文分离的野毒株N基因的450bp序列进行核苷酸同源性和基因亲缘性关系分析。

　　2  结果
　　2.1  麻疹病毒分离和鉴定  采集的31份咽拭子标本接种Vero／SLAM细胞后，5例标本于第1～2代出现了典型的麻疹巨细胞融合病变。病毒分离物经RT-PCR鉴定，有特异性的阳性条带扩增，片段大小为676bp，为预期大小的片段。
　　2.2  分离株核苷酸和氨基酸变异分析  5株麻疹野病毒之间N基因450个核苷酸和氨基酸差异分别为0%～0.2%和0%：与H2基因型代表株的核苷酸和氨基酸差异分别为：6.8%、7.2%和8.6%；与Hl基因型代表株(Chin9372)的核苷酸和氨基酸差异分别为：2.2%、2.4%之间和4.0%～4.6%之间。与Hl基因型的3个基因亚型H1a，Hlh，H1 c代表株的核苷酸和氨基酸差异分别为：1.1%、3.3%之间和2.6%、4.6%之间；与我国疫苗株沪-191(S-191)的核苷酸和氨基酸差异分别为：8.6%、8.8%和12.6%。
　　2.3  分离株基因型的确定  将所获得的5株麻疹病毒分离株编码N蛋白COOH未端的450个核苷酸片段序列与WHO Hl、H2基因型参考株，H1a，H1h，H1c基因亚型代表株和中国疫苗株沪191(S191)构建基因亲缘性关系树(图1)。结果显示，5株麻疹病毒分离株在亲缘关系树上与H1a基因亚型参考株同在一个大的分支，其可信度为95。5株新疆麻疹病毒分离株在亲缘关系树上形成独立的分支，属于H1a基因亚型。

　　3  讨论
　　1993～2008年中国疾病预防控制中心病毒病所对我国29个省麻疹病毒学监测证实，H1基因型是中国本土优势基因型[4]，对全国Hl基因型内差异的分析进一步证实Hla基因亚型逐渐成为优势流行亚型[4-5]。新疆自2004年后就开展麻疹病毒学监测，我国缺乏2004～2008年新疆流行的本土病毒株的基因特征资料，本研究对从2008年新疆成人麻疹爆发病例中分离到的5株麻疹病毒，经核酸提取，RT-PCR扩增N基因COOH末端676个核苷酸，并对此扩增产物进行序列测定分析，证实全部为H1基因型。许文波等将≥2.0%的核苷酸差异作为划分基因亚型的标准。按照此标准，H1基因型可被划分为3个基因亚型Hla，H1b和Hlc。本研究对5株新疆成人麻疹病毒株核蛋白COOH端450个核苷酸基因序列与1993～1994年中国分离的13株麻疹病毒和A基因型的代表株EDWT，S191进行同源性比较和构建基因亲缘性关系树，结果表明，新疆株和H1a基因亚型的代表株Chin9322同源性为98.7%～98.9%，较为接近，说明5株新疆株属于H1a基因亚犁；没有发现其他基因亚型；从构建的基因亲缘性关系树中也可以看出，本文中涉及的5株野病毒中，都与H1a基因亚型代表株Chin9322同处同一分支中，而与H1b和H1c亚型分支明显分离。两种分析方法显示的结果基本一致。由此看来，引起2008年新疆成人麻疹爆发的麻疹病毒属于H1基因型中的H1a基因亚型，和近儿年引起我国麻疹爆发流行的麻疹病毒无较大差异[6]。

　　参考文献
　　[1] WHO.Uptate of the nomenelature for describing the genetic characterestics of wild-type measles viruses:new genotypes and reference strains [J].WER,2003,78(27):229-232.
　　[2] WHO.Global measles and rubella laboratory network update[J].WER,2005,80(44):384-388.
　　[3] 张燕,许文波,朱贞,等.中国2003年流行的麻疹野病毒分子流行病学分析[J].中国计划免疫,2005,11(3):165-174.
　　[4] 许文波,朱贞,张珍英,等.麻疹野病毒H1基因型在中国流行的分析[J].中国计划免疫,2003,9(1):90.
　　[5] 张燕,朱贞.中国流行的麻疹病毒基因型和亚型趋势分析[J].中国疫苗与免疫,2009,15(2):97-103.
　　[6] 陈翠华.高港区2006～2008年麻疹流行病学特征分析[J].当代医学, 2010,16(33):-84.