时间：2011-01-14 12:05 来源：当代医学 作者：任懂平 肖建华
[摘要] 感染是临床常见的疾病或并发症，严重感染常常导致脓毒症、感染性休克等不良后果，由于缺乏特异性的治疗措施，目前死亡率仍然很高。因此，明确感染性疾病的发病机制并探索特异性治疗方法是当前急需解决的问题。近年来，应用细菌内毒素(如LPS)腹腔注射予小鼠复制感染性休克模型对感染性休克等疾病详细的免疫机制探讨起到了重要的作用。目前认为，脂多糖(LPS)通过与单核细胞的膜表面CD14分子或可溶性CD14分子作用，将信号从胞外传到胞核而刺激多种细胞合成和释放TNF-α、IL-1和IL-6等生物活性物质，而表现复杂的生物学活性，但其详细发病机制尚未完全清楚。本文旨在详述小鼠LPS感染模型的细胞分子免疫机制及其与人类相关疾病的差异。
[关键词] 免疫；内毒素；炎症；模型；感染
细菌、病毒等微生物入侵机体启动了机体免疫防御机制，原有和募集的各种免疫细胞在其产生的细胞因子和趋化因子等的相互作用下，发生了“正”与“邪”的斗争。为了探知这一斗争的详细机制及治疗方法，人们建立了各种感染模型，如细菌注入感染模型、内毒素模型、外伤感染模型和腹膜炎感染模型等。其中，内毒素模型便于排除其他干扰因素，有利于研究感染细菌单一成分在感染发生发展中的详细机制,为感染性休克治疗和预防提供了较好的模型[1]。本文就小鼠脂多糖感染模型的特点影响因素、分子机制、细胞学变化及其与人类相关疾病的差异综述如下。
1 脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)模型的特点、复制方法及影响因素
脂多糖模型是指应用细菌内毒素诱导动物产生与人类脓毒症相似的病理反应，是常用的脓毒症动物模型复制方法。LPS是革兰氏阴性菌主要细胞表面抗原和激发宿主对细菌感染发生反应的主要生物效应器。LPS属病原体相关分子模式(PAMP)，免疫刺激作用强[2]。它可以激活单核-巨噬细胞系统(mononuclear phagacytic system，MPS)，引起TNF-α、IL-12、IFN-γ等[3]大量炎症介质释放，导致全身过度炎症反应及脑、心、肺、肾、肝等器官的衰竭和坏死。LPS模型的免疫病理特征是固有免疫反应过度激活，伴随大量的炎性细胞因子，如TNF、IL-6、IL-1，其中最关键的是TNF[2]。常用的处理方式有：少量单次注射、少量多次注射、大量单次注射、呼吸道吸入或滴入、静脉注射等。静脉注射LPS也会出现腹腔注射时的脓毒症症状，如血液动力学改变等[4]。
LPS纯度等因素对感染模型有不同影响。Anas等应用缺乏核心多糖的rough LPS(R-LPS)和含有核心多糖的smooth LPS(S-LPS)通过CD14诱导肺部炎症反应强度具有LPS剂量依赖性。低剂量时S-LPS和R-LPS以CD14依赖的方式诱导中性粒细胞浸润。此外，低剂量S-LPS也以CD14依赖的方式诱导炎症细胞因子的释放。而高剂量S-LPS和R-LPS在存在大量可溶性CD14(soluble CD14，sCD14)时中性粒细胞浸润和释放TNF的能力降低了[5]。此外，不同性别小鼠对LPS的反应也不同，雌性小鼠较雄性小鼠更能耐受LPS打击[6]，究其原因可能与雌激素的分泌有关。
2 LPS结合蛋白-CD14-TLRs信号传导通路(LBP-CD14-TLRs Signal Transduction Path Way)
2.1 脂多糖结合蛋白(LPS-binding protein，LBP)与CD14介导细胞激活的信号传导
LBP能提高类脂A刺激腹腔巨噬细胞产生TNF-α的灵敏度和反应性，也能增强LPS诱导其它细胞因子和NO的产生，它有两个功能域，一个与LPS结合，另一个介导LPS与CD14的相互作用[7]。LPS-LBP复合物进一步与CD14结合才能刺激细胞，使信号向胞内传递而表现出生物学效应。普遍认为CD14存在两种形式：以糖基磷脂酰肌醇尾巴(glycophosphatidylinositol，GPI)锚定在单核巨噬细胞表面的膜CD14(membrane CD14，mCD14)和缺乏GPI的可溶性(soluble CD14，sCD14)。sCD14有多条生成途径，在磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C作用下，CD14阳性细胞能释放sCD14；mCD14也能通过蛋白酶从膜上降解；磷脂酶D也能催化CD14的释放，但其详细机制还不清楚；此外，CD14还可以由髓系细胞直接分泌[8]。对sCD14的研究较少，一般认为它在LPS刺激内皮细胞、上皮细胞等本身无mCD14的细胞中起了一定作用。此外，Haziot等[9]研究表明，高浓度的sCD14可以抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌TNF，从而妨碍了LPS转变为脂蛋白进而清除这一过程，表明sCD14对LPS的毒性的作用也具有两面性。
2.2 Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)
TLRs是固有免疫系统中具有重要作用的跨膜受体家族。TLRs可以识别许多微生物配体。有证据表明TLRs能够敏感地察知压力、外伤和组织缺血释放的各种内源性因子[10]。TLR家族成员很多，主要在单核巨噬细胞表面表达。现已明确，LPS可以与各种细胞表面的TLR4结合。进入血液循环的少量LPS首先与血清中LBP结合，由LBP转运给巨噬细胞表面高亲和力LPS受体(即mCD14)，LBP随之被释放，由于CD14缺乏跨膜和胞浆区，不能单独传导LPS信号，但CD14可促进LPS与TLR4结合。另外，髓样分化蛋白2(MD-2)也是TLR4识别LPS所必需的辅助分子，MD-2与TLR4结合可显著增强LPS的敏感性。TLR4识别LPS后启动活化信号，使巨噬细胞激活并参与炎症反应。一旦TLR4被激活，即可激活受体相关激酶和NF-κB，后者转位入核内诱导促炎症性细胞因子产生。缺失mCD14或TLR4的小鼠不能对LPS刺激产生强烈的应答[11]。
各种TLRs并非单独发挥作用的，各种受体之间相互作用或协同作用发挥免疫学效应。在对抗革兰氏阴性菌的固有免疫反应中TLR4和TLR9互相合作，互相补充发挥着宿主的抗菌作用。Bhan等[12]利用TLR4缺陷小鼠、TLR9缺陷及双重缺陷小鼠证实TLR4和TLR9任一缺陷都可以导致肺部感染G-菌清除率下降炎症因子分泌异常，并且证明TNF-α、IL-12及趋化因子依赖于TLR4，而IFN-γ分泌依赖于TLR9；IL-13、IL-17等因子必需TLR4和TLR9两者共同参与才能产生。此外，缺乏MyD88的小鼠较缺乏单个TLR(如TLR2、TLR4)对抗胞内、外感染的能力要弱的多，从而表明TLRs之间存在着协同作用，甚至可以代偿某个TLR的缺失[13]。
3 脂多糖感染模型的细胞学变化
免疫机能障碍及相关免疫抑制是感染后败血症综合征的标志之一。LPS感染模型中免疫细胞的数目等变化与不同的模型联系甚为紧密。有人发现感染性休克和脓毒症会出现T细胞和DCs的广泛死亡[14]，因此，感染病人和小鼠体内DCs缺失可能是免疫抑制的原因之一。Gautier等[11]发现促进LPS感染小鼠体内DCs存活可以降低亚致死量LPS诱导的免疫抑制，维持Th1细胞的分化及增强T细胞的活化和增殖。因此DCs诱导性凋亡可能是内毒素致小鼠免疫抑制和高病死率的一个决定因素，而减少DCs死亡或许是一种对抗感染性休克的有效方法。龚非力等[15]应用Jak2缺陷小鼠研究Jak2和DCs的关系，结果表明，Jak2缺陷小鼠可以显著地抵抗致死剂量LPS诱导的感染性休克，而过继正常小鼠的DCs可以恢复小鼠对LPS的敏感性；表明Jak2/STAT5是DCs发育和成熟的核心通路，但是DCs分泌促炎症因子的能力受Jak2/STAT5和Jak2/STAT6两条信号通路调节。
LPS处理小鼠可以导致幼稚的单核系细胞和粒系细胞即髓源抑制细胞(MDSCs)的增多。De Wilde等[16]应用亚致死量LPS处理小鼠两次后，可以诱导小鼠对LPS脱敏，继而用致死量LPS处理不会导致小鼠死亡。并且LPS处理后骨髓、脾脏和淋巴结CD11b+Gr1+ 细胞增加至四倍，骨髓CD11b+Gr1+细胞在第3d达到峰值，脾脏CD11b+Gr1+细胞在第7d达到峰值，这群细胞可以持续存在15d。此外，处理小鼠分泌TNF-、IL-12、IFN-r和IL-6显著下降，而IL-10分泌仅有轻微下调。最近有报道称LPS诱导产生的MDSCs可以使小鼠的移植皮肤耐受，延长移植皮肤的存活时间，其机制是通过分泌IL-10、血红素氧化酶-1(HO-1)发挥T细胞的免疫抑制作用[17]。此外，Greifenbery等[18]研究表明联合IFN-和LPS可以促进MDSCs发育和激活同时阻断髓系细胞向DCs分化。据此他们提出一种慢性感染和sepsis模型，即先使用LPS激发宿主固有免疫反应，随后模拟适应性免疫反应产生大量的T细胞分泌大量IFN-。他们证实LPS结合IFN-是刺激MDSCs累积和封闭DCs的绝好范例之一。
4 LPS感染模型与人类感染疾病的差异
有研究证实抑制脂多糖感染模型的促炎性因子具有明显的治疗效果；然而，该方法临床效果却不明显[18]，其原因可能是脂多糖模型与临床感染疾病之间存在很大的差异。例如，大量注射LPS导致全身炎性细胞因子水平急速上升，而人类感染和sepsis细胞因子水平升高并不十分明显，并且相对延后[19]。此外，对比人类和小鼠对LPS的反应，证实小鼠对LPS有相对的耐受性，表明不同物种的内毒素敏感性有一定的差异，这种差异影响了动物模型的临床相关性[20]。另外，注射LPS的剂量和诱导DCs的凋亡相关，给小鼠注射LPS 48h后DCs减少，4～5dDCs出现大量缺失；而人类感染病人1～2d DCs出现大量缺失[11]，较小鼠敏感。
5 结语
多年来，对细菌体内各部分功能的了解和对宿主——细菌相互作用机制的深入研究，也促进了临床对细菌感染疾病的治疗和预防。然而，由于不同致病菌具有不同的结构，免疫系统需要同时做出一般性反应和特异性反应。大量实验揭示了诸如TLRs、IL-1、IL-6等关键分子，在哺乳动物宿主识别和清除病原体的“战役”中发挥重要的作用。不同感染模型的受体和细胞因子通路也不完全相同，因此不能将动物实验中有效的治疗方法简单地应用于人类临床治疗[18]，需要结合人类相关疾病的特点多层次分阶段的治疗。此外，也需要不断地改进LPS感染模型如联合使用某些试剂(如IFN-r[18]等)复制动物模型，使之具有更多的临床相关性。
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作者单位：421001 南华大学病原生物研究所 (任懂平 肖建华)