时间：2011-01-14 11:36 来源：当代医学 作者：陈茜 蔡东阁
[摘要] 目的 探讨局部化疗前后宫颈癌组织中凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达及细胞凋亡的变化及临床意义。方法 应用免疫组织化学法检测接受及未接受局部化疗的宫颈癌组织中Bcl-2、Bax蛋白的表达，流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 接受局部化疗的宫颈癌组织中，Bcl-2表达降低，bax表达升高，细胞凋亡率上升。卵巢组织中情况相同。结论 局部化疗可能诱导了肿瘤细胞的凋亡，Bcl-2/Bax平衡的改变参与了凋亡调控，同时局部化疗对卵巢组织也有一定程度的影响，可能具有降低宫旁转移率、预防肿瘤细胞扩散的作用。
[关键词] 局部化疗；凋亡;宫颈癌;Bcl-2；Bax
[Abstract] Objective To study the apoptosis and the expression of apoptosis-related gene bcl-2 and bax in the cervical carcinoma cells with and without local chemotherapy and to determine the mechanism of local chemotherapy and its clinical significance. Methods The expression of bcl-2 and bax were evaluated by immunohistochemistry in 40 specimens of cervical cancer and flow-cytometry was introduced in the study of apoptosis. Results In the tumors with and without local therapy, the expressions of bcl-2 was down.The expressions of bax was rise. The positive rates of apoptosis was up.It was same in the ovary. Conclusion The local therapy may induce the apoptosis of tumor cells, which also has influence on the ovary to depress parametrial metabasis and prevent the diffusion of the tumor cells. The changes of the balance between bcl-2 and bax may participate in the regulation of apoptosis. The expressions of Bcl-2 and Bax and the ratio of Bcl-2/Bax might be the evaluation index of the sensitivity of the local chemotherapy and the effect of therapy.
[Key words] Local therapy; Apoptosis; Cervical cancer;Bcl-2;bax
宫颈癌是全球范围内最常见的妇科恶性肿瘤之一，在我国妇女中发病率居高不下,并趋向年轻化，故对其治疗方法提出了新的挑战。放疗不再是首选治疗方法，随之出现的新辅助化疗越来越受到重视，尤其对于希望保留卵巢功能的年轻患者具有重要意义。宫颈是一个可暴露器官，容易直接治疗和观察，局部化疗操作方便，不需麻醉，副作用轻，具有一定的优越性。本研究通过检测局部化疗前后宫颈癌组织中凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达及细胞凋亡的变化，初步探讨局部化疗的作用机制，为制定个体化治疗方案和提高疗效提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 临床资料 选取2007年～2009年在我院住院治疗的宫颈鳞状细胞癌患者40例，年龄平均45.17岁，所有患者按国际妇产科联盟FIGO分期标准进行分期：Ⅱa期23例，Ⅱb期17例，病理分级鳞状细胞癌Ⅱ级28例，Ⅲ级12例；均行广泛性子宫切除加盆腔淋巴结清扫术；在手术前未曾接受放疗及全身化疗等其他辅助治疗。其中治疗组选取在手术前接受宫颈局部化疗患者20例，对照组选取手术前未接受过任何辅助治疗患者20例。
1.2 方法
1.2.1 宫颈癌病灶局部注射化疗 将顺铂30～50mg加生理盐水10mL稀释，嘱患者排空大小便后取膀胱截石位，用20mL注射器套长7号针头,将溶解后的适量顺铂在宫颈病灶周边多点注射入肿瘤基底部。根据肿瘤大小决定注射针距,一般外生型穿刺深度为1～5cm，每点推注2～3mL；溃疡型穿刺深度为0.3～1.0cm，每点推注1～2mL。依肿瘤退缩情况决定注射次数，一般2～3次，最多5次，顺铂累计总量60～160mg。每3天一次，停药一周后手术。
1.2.2 Bcl-2、Bax表达的检测 采用免疫组织化学S-P法。取同一患者手术切除的宫颈癌病灶组织及卵巢组织各一块，置于10%甲醛溶液中固定,石蜡包埋，4～5μm厚连续切片。二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，抗原热修复。3%H2O2室温20min，10%正常山羊血清封闭，室温孵育20min，弃血清，滴加稀释后的一抗(两个抗体的稀释度及来源)，4℃过夜。37℃复温1h，PBS冲洗。PBS冲洗，DAB显色15min。自来水充分冲洗，苏木精复染，梯度乙醇脱水，透明，中性树胶封片。
1.2.3 细胞凋亡的检测 采用流式细胞仪检测细胞凋亡率[1]。取患者手术切除新鲜宫颈癌癌灶及卵巢组织标本，剪碎，加入胰酶2mL静置5min，加PBS液4mL，吹打。放入120目尼龙网过滤，滤液1000r/min离心7～8min。去上清，再加PBS液吹打，再次离心。加入PI(碘化丙啶)150μmL，4℃避光染色20min后上机操作。
1.3 结果判定
1.3.1 免疫组织化学检测结果判定 每标本切片均随机选取5个高倍视野(400倍)，每视野计数200个细胞，瘤细胞内出现棕黄色颗粒判断为阳性。根据阳性细胞所占百分比分级: 阳性细胞数<5%为阴性(-)；5%～50%为阳性(+)；>50%为强阳性(++)，在判断上兼顾阳性染色的强度及数量[2]。
1.3.2 流式细胞仪检测指标 未经宫颈局部化疗患者以及局部化疗患者手术切除新鲜标本中局部病灶、卵巢组织中DNA周期及细胞凋亡指数。
1.4 统计学分析 采用SPSS10.0软件包进行统计学处理，计数资料采用统计学x2检验及直线相关性分析。
2 结果
2.1 Bcl-2和Bax在宫颈癌组织以及卵巢组织中的表达 免疫组化结果显示，Bcl-2和Bax的阳性颗粒均分布在细胞浆内，为胞浆型，呈局灶性分布，少部分呈弥漫分布。宫颈癌组织Bcl-2表达呈下降趋势，Bax表达呈上升趋势，治疗组bcl-2/bax比值明显低于对照组。治疗组卵巢组织Bcl-2表达呈下降趋势，Bax表达呈上升趋势，治疗组Bcl-2/Bax比值低于对照组(表1)。
表1 对照组与治疗组Bcl-2、Bax的表达及bcl-2/bax比值
Tab 1 Expressions of Bcl-2, Bax and the the ratio of Bcl-2 and Bax with and without local chemotherapy
tumor ovary tumor ovary tumor ovary
control group 60(12/20) 80(16/20) 45(9/20) 30(6/20) 1.3333 2.6667
与对照组比较(vs control group): *P<0.05， ** P<0.005.
2.2 局部化疗对宫颈癌细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示，凋亡细胞在流式细胞仪的DNA直方图上呈特征的亚二倍体峰。宫颈癌组织细胞凋亡率治疗组为(45.36±2.37)%，对照组为(12.93±4.96)%，治疗组高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。卵巢组织细胞凋亡率治疗组为(35.64±5.43)%，对照组为(10.05±1.29)%，治疗组高于对照组，差异亦有统计学意义(P<0.05)。
2.3 细胞凋亡率与bcl-2,bax表达的相关性分析 宫颈癌癌灶中，细胞凋亡率与bcl-2表达呈反相关(r=-0.9633,P<0.05)，即随着bcl-2表达的下降细胞凋亡率上升；细胞凋亡率与bax表达呈正相关(r=0.9694,P<0.05)，即随着bax表达的上升细胞凋亡率上升；细胞凋亡率与bcl-2/bax比值呈负相关(r=0.9529，P<0.05)，即随着bcl-2/bax比值的下降细胞凋亡率上升。卵巢组织中细胞凋亡率与bcl-2/bax表达的相关性同癌灶。
3 讨论
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，在我国宫颈癌发病率居高不下，并趋向年轻化，故对其治疗方法提出了新的挑战。常规的放疗或全身化疗对早期宫颈癌有较好的效果，但对中晚期及高危宫颈癌患者的疗效仍不满意。宫颈癌局部化疗利用子宫与外界相通这一自然腔隙，把顺铂直接注射到宫颈肿瘤组织内，以达到局部浓度大而全身副作用少的优点。对于癌灶较大有手术困难的患者，可在术前瘤体局部注射化疗药物以缩小肿瘤体积，提高手术疗效。局部化疗还可以增强肿瘤组织对放射线的敏感性，对于中晚期宫颈癌患者在放疗前辅以局部化疗，可大大提高放疗的疗效[3]。
以往认为，肿瘤的发生是原癌基因的激活及抑癌基因的失活导致细胞增生过度和分化异常所致，现证实肿瘤的发生亦是细胞凋亡异常的结果[4]。在宫颈癌中不仅有细胞的过度增殖，同时还存在细胞的凋亡异常,两者是宫颈癌发生的生物学基础[5]。细胞增殖与死亡之间的动态平衡对生物体的正常发育至关重要,肿瘤的发生正是这种动态平衡被打破、细胞数量恶性膨胀的结果。bcl-2是目前研究最多的与细胞凋亡关系密切的基因之一，bax基因是近年来新发现的一种凋亡促进基因，属bcl-2同一家族，其不但拮抗bcl-2的抑制凋亡作用，而且有直接促进细胞凋亡的功能[6]。bcl-2/bax的比值[7]，对于决定细胞接受刺激信号后存活与否有关键作用。Oltvai[8]研究证明在宫颈癌组织中bcl-2占优势可使bax同型二聚体减少，bcl-2/bax异型二聚体增多，肿瘤细胞对凋亡的敏感性降低，使之易于逃避凋亡原的刺激，致使瘤细胞存活期延长，导致肿瘤不断增大，说明在宫颈癌发生发展中，细胞凋亡是肿瘤抵抗恶性转化的关键防御机制[9]。易慕华等[10]发现bcl-2的表达为全浆型或核周型为主，而这一部位也正好是bax失表达部位，提示细胞凋亡的激活可能与bcl-2/bax的表达失衡有重要关系。
本实验结果显示经过局部化疗的宫颈癌癌灶及卵巢组织中细胞凋亡明显高于未经过局部化疗组，bcl-2表达降低而bax表达上升，bcl-2/bax比值有下降趋势且与细胞凋亡率有相关性。提示宫颈癌的发生发展与细胞凋亡密切相关，局部化疗可能诱导了肿瘤细胞的凋亡，同时对于卵巢组织也有一定程度的影响，从而可降低宫旁转移率[11]。bcl-2/bax平衡的改变参与了凋亡调控，bcl-2、bax的表达情况以及bcl-2/bax比值变化可作为局部化疗敏感性和治疗效果的评价指标。
宫颈癌局部化疗近期疗效肯定，操作方便，虽有一定的技术要求，但无明显痛苦，不需麻醉，不需静脉水化。与其他途径化疗相比所需时间短，无穿刺疼痛和静脉炎发生，全身毒副作用轻，使病人生存质量得到了有效的提高,在中晚期及高危宫颈癌病人的治疗中具有巨大的潜在价值。
参考文献
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作者单位:710004 西安交通大学医学院第二附属医院妇产科 (陈茜 蔡东阁)