白藜芦醇对高糖环境近端小管上皮细胞氧化应激的影响

[摘要]  目的  白藜芦醇对高糖诱导的近端小管上皮细胞(proximal tubule epithelial cells,PTEC)氧化应激的影响。方法  采用手工微分离法体外培养大鼠PTEC，行免疫细胞化学法鉴定细胞类型。将细胞分为正常对照组(NC)(DMEM培养基)、高糖组(25mmol/L)、白藜芦醇治疗组(高糖+Res组)，化学比色法测定各组PTEC的一氧化氮(nitrogen monoxidum,NO)、过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone,GSH)水平和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性。结果  高糖组NO和H2O2显著高于NC组(P＜0.01)；高糖+Res组NO和H2O2与高糖组比较明显降低(P＜0.05)；高糖组CAT活性和GSH水平显著低于NC组(P＜0.05)；高糖+Res组CAT活性和GSH水平较高糖组明显升高(P＜0.05)，与NC组比较无明显差异。结论  白藜芦醇具有抑制氧化应激和增强抗氧化能力，来发挥对糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)的防治作用。    
　　[关键词]  白藜芦醇；近端小管上皮细胞；氧化应激

　　
　　[Abstract]  Objective To observe the effect of Resveratrol on oxidative stress of rat proximal tubule epithelial cells (PTEC) under high concentration of glucose Methods PTEC were cultured with microdissected freehand and cells types identified by immunocy-tochemistry The cells were divided and cultivated in the following medium containing DMEM (control group),25mmol/L glucose,25mmol/L glucose and resveratrol respectively The level of NO, H2O2, GSH and CAT of PTEC was determined by chemical colorimetric method.Results The level of NO and H2O2  was significantly increased in high glucose concentration group than that in control group(P＜0.01)however, the level was obviously decreased in low, 25mmol/L glucose and resveratrol and high glucose concentration group(P＜0.05)The activity of CAT and GSH  was significantly decreased in high glucose concentration group than that in control group(P＜0.05); however, the activity was obviously increased,25mmol/L glucose and resveratrol and high glucose concentration group(P＜0.05) Conclusion Resveratrol can inhibit oxidatie stress and enhance oxidation resistance, to play the role in prevention and treatment of diabetic nephropathy.
　　[Key words]  Resveratrol; Proximal tubule epithelial cells; Oxidative stress

　　糖尿病是我国中老年人常见的疾病，糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最为严重的并发症之一，也是临床上导致糖尿病患者死亡的主要原因之一。近年来随着对自由基氧化损伤的不断深入研究，证实氧化应激是糖尿病及并发症发生的主要病理生理机制之一[1]。应用抗氧化治疗，改善氧化应激可延缓糖尿病并发症的发展。白藜芦醇(Resveratrol，Res)是一种含有芪类结构非黄酮类多酚化合物，许多基础研究和临床观察均表明，白藜芦醇具有广泛的药理作用[2]。本实验试图观察白藜芦醇对高糖诱导的近端小管上皮细胞(proximal tubule epithelial cells,PTEC)氧化应激的影响，进一步为白藜芦醇防治DN的临床应用提供理论依据。 
　　1  材料与方法
　　1.1  实验材料
　　1.1.1  实验动物  健康雄性Wistar大鼠，清洁级，标准饲养，自由饮水，日常光照。
　　1.1.2  试剂与仪器  白藜芦醇，永州一东生物技术有限责任公司(＞98%)；优级胎牛血清，北京索莱宝科技有限公司；DMEM培养液，Giboc公司；DAB显色试剂及SABC(Mouse IgG)试剂盒，武汉博士德公司；一氧化氮检测试剂盒、过氧化氢检测试剂盒、过氧化氢酶检测试剂盒和还原型谷胱甘肽检测试剂盒，均购自碧云天生物技术研究所；全自动酶标检测仪，ELX800型，美国。
　　1.2  原代近端小管上皮细胞的培养及鉴定  用手工微分离法分离大鼠单根近端小管，原代培养大鼠近端小管上皮细胞。将近端肾小管置入2mlDMEM培养液的培养瓶中，置于37℃ 5%CO2的培养箱中原代培养，于第3天更换第1次培养液，7～8d细胞基本铺满瓶底。免疫细胞化学SABC法鉴定细胞。
　　1.3  实验分组  用MTT法检测高糖和Res对细胞增殖的影响，由此选出高糖及药物浓度。PTEC生长至基本铺满瓶底，将其消化并接种于96孔板，24h后更换为无血清DMEM低糖培养液培养24h使细胞同步化，以后将细胞分为以下三组：正常对照组(NC)(DMEM培养基)，高糖组(25mmol/L)，白藜芦醇治疗组(高糖+Res组)，每组设6个复孔，作用72h后取样观察。
　　1.4  氧化应激指标的测定  分别用化学比色法测定PTEC的一氧化氮(nitrogen monoxidum,NO)、过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone,GSH)水平和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性，均按照试剂盒说明书操作。
　　1.5  统计学方法  实验数据均以均数±标准差(x±s)表示。全部资料用SPSS13.0统计软件进行统计分析，组间比较用t检验和方差分析。检验水准a=0.05，P＜0.05为有统计学意义。
　　2  结果
　　2．1  对PTEC氧化应激的影响NO水平  高糖组显著高于NC组(P＜0.01)，高糖+Res组与高糖组比较明显降低(P＜0.05)，与NC组比较无明显差异；H2O2水平：高糖组显著高于NC组(P＜0.01)，高糖+Res组较NC组仍明显升高(P＜0.05)，但较高糖组明显降低(P＜0.05)。见表1。

表1 各实验组对PTEC氧化应激的影响（ ±s）

组别          NO                        H2O2            (umol/㎎ pro)            (umol/㎎ pro)

NC组         0.24±0.11                  5.29±2.03 高糖组        0.71±0.24**               30.51±14.49** 高糖+Res组    0.26±0.09#                12.34±7.68*#

注：与NC组比较，* P＜0.05，**P＜0.01；与高糖组比较，^# P＜0.05（下同）

　　2.2  对PTEC抗氧化能力的影响  CAT活性：高糖组显著低于NC组(P＜0.05)，高糖+Res组较高糖组明显升高(P＜0.05)，与NC组比较无明显差异；GSH水平：高糖组明显低于NC组(P＜0.05)，高糖+Res组较高糖组明显升高(P＜0.05)，与NC组比较无明显差异。见表2。

表2 各实验组对PTEC抗氧化能力的影响（ ±s）

组别           CAT                      GSH           (umol/㎎ pro)         (umol/㎎ pro)

NC组            9.24±1.06             2.29±0.12 高糖组           8.71±1.24*            1.69±0.05* 高糖+Res组      9.26±0.49#             2.14±0.28#

　　3  讨论
　　氧化应激是指机体组织或细胞内氧自由基生成增加或清除能力降低，导致活性氧家族(reactive oxygen species,ROS)在体内或细胞内蓄积而引起的氧化损伤过程。大量研究均表明，糖尿病存在明显的氧化应激，氧化应激可能是糖尿病血管并发症的始动因素,高血糖状态下产生大量ROS[3]。目前临床上对DN尚无根治的措施，主要是对症治疗和改善症状为主，疗效并不十分满意。采用中医中药的方法是我国在DN治疗上的独到优势，白藜芦醇在治疗方面的作用尤其引人注目。尽管证实氧化应激在糖尿病血管并发症中的主导作用，但抗氧化治疗并不乐观，药物的选择、剂量、疗程、作用位点等因素都是尚待研究的重点。目前提出的抗氧化病因学治疗有望成为主要的治疗方案。
　　本实验结果显示高糖环境培养的PTEC NO和H2O2水平明显增加，白藜芦醇加入高糖环境培养的PTEC NO和H2O2水平明显受到抑制。王翠珍等[4]用CDNA探针与基因表达谱芯片杂交技术表明2型糖尿病大鼠肾脏组织某些抗氧化应激相关基因表达明显降低，说明肾脏抗氧化防御机能减退、氧化应激作用增强在DN中起重要作用。NO是内皮细胞合成和释放的一种内皮源性舒张因子，参与多种生理和病理过程，有强烈的舒血管作用，在调节肾血流动力学方面起重要作用，也在DN的病因学上有重要意义。Baines等[5]研究表明3～5周的糖尿病大鼠近端小管不仅一氧化氮合酶蛋白表达和其活性均升高。正常状态下，肾脏有完整的抗氧化酶保护系统。Antonio等[6]研究发现，肾脏抗氧化防御机制的减弱可能在DN的发生、发展中起重要作用，其中CAT和GSH是两种重要的抗氧化的物质，CAT主要清除高浓度的H2O2。已发现在糖尿病大鼠的大脑和心脏的CAT活性升高，但在肝脏和肾脏却降低[7]。GSH是细胞内重要的还原剂，直接的自由基清除剂，把H2O2还原成H2O，其自身被氧化为氧化型谷胱甘肽。在用化学的方法诱导的糖尿病动物肾脏中GSH浓度降低。本研究也发现高糖环境培养的PTEC GSH水平与CAT活性均明显降低，白藜芦醇治疗后可抑制PTEC的GSH水平和CAT活性的降低。
　　本实验结果提示白藜芦醇甙不仅有抑制氧化应激的作用，还有增强抗氧化能力。由此进一步表明白藜芦醇甙具有防治DN的作用，这为抗氧化剂治疗DN提供了理论依据，此作用可能通过抑制氧化应激和增强抗氧化的防治功能或别的途径来实现的，其具体相关机制仍需要进一步的研究。

　　参考文献
　　[1] 刘影,田浩明.氧化应激与糖尿病[J].华西医学,2007,22(1):194-195.
　　[2] 张宝红.白藜芦醇药理研究进展[J].现代医院,2008,8(3):66-68.
　　[3] Yorek MA.The role of oxidative stress in diabetic vascular and neural disease[J].Ferr Radic Res,2003,37(5):471-480.
　　[4] 王翠珍,林丽香,陈刚,等.2型糖尿病大鼠肾脏组织氧化应激相关基因的表达[J].海峡预防医学杂志,2005,11(2):3-5.
　　[5] Baines A,Patrick HO.Glucose stimulate O2 consumpion,NOS,and Na/H exchange in diabetic rat proximal tubules[J].Am J Physiol Renal Physiol, 2002,283(2):286-293.
　　[6] Antonio C,Anna M,Franceschina M,et al.Defective intracellular antioxidant enzyme production in type 1 diabetic patients with nephropathy[J].Diabetes,2000,(49):2170-2178.
　　[7] Inoguchi T,Li P,Umeda F,et al.High glucose level and free fatty acid stimulate reactive oxygen species production through protein kinase C-dependent activation of NADPH oxidase in cultured vascular cells[J].Diabetes,2000,49(11):1939-1945.

　　作者单位:462002  漯河医学高等专科学校生理学教研室 (王兴红  李德恒)