糖尿病小鼠大脑记忆功能及生化指标变化的实验研究

[摘要]  目的  研究糖尿病小鼠记忆功能及生化指标的变化。方法  用四氧嘧啶(ALX)和链佐霉素(STZ)溶液分别给小鼠腹腔注射建立糖尿病模型,测定造模后小鼠血糖含量。另设正常对照组。待造模小鼠血糖明显稳定升高后，用y型水迷宫测定小鼠的记忆功能。记录每天小鼠的饮水量。实验结束，从小鼠眼球取血，分离血清，测定血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、尿素含量。结果  用四氧嘧啶造模2周小鼠正常组和造模组血糖含量分别是(6.84±1.01)、(16.88±5.97)mmol/L(比较P<0.01)；水迷宫时间分别为(4.09±1.42)、(19.62±11.15)s(P<0.05)；饮水量分别为(3.00±0.34)、(32.50±2.68)ml/d/只(P<0.01)；甘油三酯(TG)分别为(1.64±0.63)、(2.75±0.38)mmol/L(P<0.05)；总胆固醇(TC)分别为(1.57±0.18)、(2.37±0.39)mmol/L(P<0.05)；尿素分别为(8.64±0.93)、(14.76±2.76)mmol/L(P<0.05)；链佐霉素造模小鼠正常组和造模组血糖分别为(6.66±0.44)、(11.65±3.36)mmol/L(比较P<0.01)；水迷宫时间分别为(5.20±0.72)、(8.87±3.53)s(P>0.05)；血清总胆固醇分别为(1.23±0.25)、(1.89±0.43)mmol/L(P<0.05)。结论  造模小鼠随着血糖浓度升高记忆功能下降，饮水量增加,血清甘油三酯、总胆固醇、尿素造模组均明显高于正常组。
　　[关键词]  糖尿病；小鼠；记忆功能

　　[Abstract]  Objective  Study of memory function in diabetic mice and biochemical indicators of change. Methods  With alloxan (ALX) and streptozotocin (STZ) solution, respectively, to the establishment of diabetic model mice by intraperitoneal injection. Determination of blood glucose levels in mice after modeling. Separate the normal control group. Modeling to be a stable blood glucose in mice significantly increased after water maze measured with y-type mice memory function. Record the amount of daily drinking water in mice. End of the experiment, blood taken from mouse eye, separation of serum, serum triglyceride (TG), total cholesterol (TC), urea concentration. Results  Modeling with alloxan in mice with normal blood sugar levels, and build modules were (6.84?.01),(16.88?.97)mmol / L (comparisonP<0.01): Morris water maze time was (4.09?1.42),(19.62?1.15)s(P<0.05); Water intake were (3.00?.34),(32.50?.68)ml / days / only (P<0.01); Triglyceride (TG) were (1.64?.63),(2.75?.38)mmol / L (P<0.05) Total cholesterol (TC) were (1.57?.18),(2.37?.39)mmol / L (P<0.05) Urea were (8.64?.93),(14.76 ?2.76)mmol / L (P<0.05); Streptozotocin model in mice made the normal glucose group and model group were (6.66?.44),(11.65?.36)mmol / L (comparison P<0.01); Morris water maze time was(5.20?.72),(8.87?.53)s(P>0.05); Serum total cholesterol were(1.23?.25),(1.89?.43)mmol / L (P<0.05). Conclusion  Modeling in mice with blood glucose concentration and memory decline in water intake increased, serum triglyceride, total cholesterol, urea-made modules were significantly higher thanthe normal group.
　　[Key words]  Diabetes; Mice; Memory

　　糖尿病是一种因部分或完全胰岛素缺失或细胞胰岛素受体少或受体敏感性降低导致的糖代谢紊乱疾病[1]，是除了肥胖症之外人类最常见的内分泌紊乱疾病，也是被医学界列为继癌症、心血管疾病之后的全球第三位疑难疾病。除发病机理复杂、发病率高、并发症严重、尚无根治药物外,发病率逐年增加的速度相当高。据预测,全球糖尿病患者将从2006年的2.46亿增至2025年的3.8亿[2]。目前研究发现，在糖尿病患者中，老年痴呆症发生率高于其他人群[3]。本文以糖尿病小鼠为研究对象，通过y型水迷宫游水时间和错误测定小鼠的记忆功能，并与血糖和其他生化指标进行比较分析。现将实验结果报道如下。

　　1  试剂与方法
　　1.1  试剂
　　四氧嘧啶, 链佐霉素，分析纯，为Sigma产品。邻甲苯胺、硫脲、硼酸、柠檬酸，均为国产分析纯。甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、尿素测定试剂盒，购自四川成都迈克科技有限公司。
　　1.2  小白鼠
　　40只昆明种，雌雄随机，健康，鼠龄60d。购自本校动物室。分笼喂养，每笼5只。
　　1.3  动物模型的建立[4]
　　四氧嘧啶模型，准确称取四氧嘧啶，按200mg/kg计算，用蒸馏水溶解稀释，给20只小鼠(已称体重)作腹腔注射(一次注射)。链佐霉素模型，准确称取链佐霉素，按每日50mg/Kg计算,用0.1mol/L柠檬酸溶液适量溶解稀释，给12只小鼠作腹腔注射，每日1次，连续3d。另设正常对照组8只，用等体积称生理盐水，方法相同。测定72h、7d、2周、4周、8周后小鼠血糖含量。
　　1.4  测定方法
　　血糖测定，从小鼠尾巴取血20μL，用邻甲苯胺微量法测定[5]。TG用GPO-PAP法测定；总胆固醇(TC)用COD-CE-PAP法测定；尿素用脲酶波氏法测定，具体操作参照试剂盒说明书。
　　1.5  记忆力测定
　　用y型水迷宫[6]，长1.5m，水深20cm。每只小鼠在水迷宫中训练4d，每天游水3次，等其熟悉逃避地点上岸。休息1d后测定，记录下水到达上岸的时间(s)和错误的次数，每次最长时间限定为40s，超过40s按40s计，并当作失败。走进一个盲端算错误一次。每天测定3次，连续测定3d。
　　1.6  饲养
　　小鼠从本校动物室购买的标准混合固体颗粒饲料喂养。饮水为自来水，自由饮用，但每天记录每只小鼠的饮水量。
　　1.7  统计学处理
　　用统计学软件进行方差分析，计量资料用x±s表示。
　
　　2  结果
　　2.1  四氧嘧啶造模结果
　　四氧嘧啶造模20只,死亡8只，死亡率占40.0%,血糖在11.1mmol/L以上7只,作为成功列入统计。链佐霉素造模12只，无死亡, 列入统计6只(50.0%)。
　　2.2  2种造模小鼠2周血糖测定结果
　　2种造模方法建立的糖尿病模型小鼠，其2周血糖含量均明显高于正常对照组(P<0.01)，而四氧嘧啶模型明显高于链佐霉素模型。两种模型组小鼠的饮水量也明显高于正常组(P<0.01)但四氧嘧啶模型组更高于链佐霉素模型组，与血糖几乎有平行关系，见表1。

表1  2种造模小鼠血糖含量测定结果

注：^△△表示P<0.01。

　　2.3  水迷宫测定结果
　　结果显示，四氧嘧啶模型小鼠水迷宫到达时间(s)明显长于正常组(P<0.05)，错误次数和失败次数也明显多于正常组；链佐霉素模型小鼠到达时间虽稍长于正常组，但尚不够明显(P>0.05)，错误次数模型组也多于正常组，但2组均未出现失败,见表2。

表2  2种模型小鼠水迷宫测定结果

注：^△表示P<0.05。

　　2.4  2组血清生化指标测定结果
　　结果显示，四氧嘧啶模型组TG、TC和尿素均明显高于正常组(P<0.05)；链佐霉素模型组TC明显高于正常组(P<0.05)，尿素含量两组间无显著性差异，TG相反，正常组明显高于模型组(P<0.05)。见表3。

表3  模型小鼠血清TG、TC和尿素含量比较

注：^△表示P<0.05。

　　3  讨论
　　3.1  造模小鼠血糖明显升高，饮水量也明显增加
　　用四氧嘧啶造模的小鼠血糖高于链佐霉素造模的小鼠血糖，同时每天每小鼠饮水量前者也高于后者。2种造模方法血糖前者并非一定高于后者，可纯与用药剂量有关。但血糖的高低与饮水量的多少应是有一定的平行关系。用四氧嘧啶造模死亡率死亡率较高，用链佐霉素造模较低，但血糖也较低.
　　3.2  造模小鼠记忆力功能有明显下降，与文献报道相符合[3]
　　四氧嘧啶模型小鼠水迷宫到达时间明显长于正常组，且失败次数和错误次数明显增多，说明其记忆功能较正常组差；链佐霉素模型组水迷宫到达时间也较长于正常组，但尚不明显，错误次数也明显多于正常组，但尚未有失败，说明其记忆功能有一定的降低，但比四氧嘧啶组轻，这可能与其血糖较低于前者、病情较轻有关。国外调查显示，中年糖尿病患者年老后患痴呆症，尤其是早老性痴呆症(阿尔茨海默氏症，AD)的风险高于常人。调查显示，随着年龄的增长，痴呆症的发病率逐渐增多，65岁以后总的痴呆症发病为10%左右，大于85岁以上，升到35%～40%。而糖尿病患者中每年有12%～15%轻度认知损伤(MCl)轻度为阿尔茨海默病(AD)。患糖尿病15a以上认知障碍发病率为非糖尿病患者的1.4～3.2倍。研究证实，糖尿病可以导致中枢神经系统的代谢、神经化学、形态学、电生理及神经行为等多方面的改变，特别是与学习、记忆等认知功能有关的海马区部位神经细胞的损伤，而其作用机制更为复杂，其中之一如糖尿病患者醛糖还原酶(AR)活性增高，山梨醇通路激活引起山梨醇在体内数信量的积聚。由此引起细胞内高渗与水肿状态，继而直接损伤细胞的结构和功能。现已证明，患者肾脏、神经、视网膜、晶状体内山梨醇明显升高。其他尚有糖尿病患者自由基产生过多和清除障碍，胰岛素抵抗与高胰岛素血症等，均认为与记忆障碍发生有关。
　　此外，血清甘油酯(TG)、总胆固醇(TC)和尿素，四氧嘧啶模型组明显高于正常组，与文献报道相一致[7]。血清尿素明显增高，提示肾功能有一定的损害。链佐霉素模型组除血清总胆固醇明显高于正常组外(P<0.05)，尿素含量两组间无明显差异(P>0.05)，除了本组病情较轻的原因外，还有待进一步探论。

　　参考文献
　　[1] 查锡良.生物化学[M].7版,北京:人民卫生出版社出版,2008:117-118.
　　[2] 黄胜炎.糖尿病治疗药研发新进展[J].上海医药,2009,30(8):376-379.
　　[3] 唐伟,刘超,徐述.糖尿病与认识功能障碍[J].国外医学:老年医学分册,2003,24(3):120-123.
　　[4] 覃雯,唐爱华.糖尿病实验性动物模型研究概况[J].时珍国医国药,2007,18(6):1511-1512.
　　[5] 安乙敏.生化检验学[M].成都:四川科学技术出版社出版,1990:68.
　　[6] 张树球.黄秋艳,李朝敢,等.用Y型水迷宫测定锌与海尔福口服液对铝染毒所致小鼠记忆障碍的改善作用[J].中国冶金工业医学杂志,2006,23(5):546-548.
　　[7] 钱立荣.糖尿病与血脂异常[J].中国糖尿病杂志,2000,10(2):125.