见表1和表2。
表1血浆DNA定量检测
|
血浆DNA（ng） |
检测偏差 |
|
投入量 |
实测值 |
|
2 |
1.9 |
-5% |
|
10 |
8.0 |
-20% |
|
20 |
17.2 |
-14% |
表2血清DNA定量检测
|
血清DNA（ng） |
检测偏差 |
|
投入量 |
实测值 |
|
10 |
1.28 |
28% |
|
20 |
22.8 |
14% |
|
200 |
218.0 |
9% |
2.3 检测方法的重复性 重组质粒和p-actin基因扩增Ct值的批内CV分别为1.2%和0.8%。双重荧光定量PCR定量检测的批内重复20次，CV值为11%，批间重复9次，CV值为17%。
3 讨论
随着对血液循环DNA定量检测的深入探索，科学家们发现，各个研究报道之间的血液循环DNA定量结果存在较大的差异。一方面，各报道针对的研究对象不同(地域、种族、疾病类型、年龄、性别等)；另一方面，所有关于血液循环DNA定量检测研究都需要进行血浆血清样本的收集、核酸的提取纯化，血浆血清样本和DNA样品的长期保存，以及建立各自的定量标准曲线，由于这些不确定因素，使得各研究结果之间存在很大的差异，数据缺乏可比性。这些问题已经引起了国内外学者的关注，然而至今仍然没有很好的解决办法[1-2]。本文针对上述问题，合成了与人类基因组无同源性的人工重组质粒(2733bp)，作为定量检测的内参照物，并以人血液循环DNA中的看家基因p-actin作为目的基因，首次建立了带有内参照物的血液循环DNA双重实时荧光定量PCR定量检测方法，旨在通过内参照物的设立，对血液循环DNA的提取纯化和长期保存进行全面的质量控制，从而更加准确地对血液循环DNA进行定量检测研究。本实验中的内参照物(重组质粒DNA)与人类基因组为非同源性，使得内参照物与目的基因(p-actin)的扩增互不干扰；另一方面，针对两者扩增的Taqman探针分别采用不同的荧光素(FAM和JOE)进行标记，并在荧光定量PCR仪的不同通道对上述两种荧光信号分别进行检测，从而能够独立地对内参照物和目的基因的扩增情况进行分析，极大地提高了扩增反应的特异性，便于后续的数据分析。由于血液循环DNA微量的特性，其定量检测的敏感性在很大程度上取决于核酸的高质量提取。从传统的酚/氯仿法到目前多种微量核酸提取试剂盒，核酸提取方法正日益向高效、便捷、稳定的方向发展。本研究通过比较传统的酬氯仿法以及三种较为常用的DNA提取试剂盒对模拟血浆中小片段质粒DNA的提取效率和提取的批内重复性，选择了磁珠法DNA提取试剂盒。该方法对重组质粒DNA的提取效率较高(71.4%)、重复性较好(CV=26%)，适合于像血液循环DNA这样的微量小片段核酸的提取和纯化[3]，对于后续实验起到非常重要的作用。本文针对建立了带有内参照物的定量检测的方法，从血液循环DNA的提取纯化，到实时荧光定量PCR扩增，内参照物在整个定量检测过程中可以对各个环节中可能出现的偏差起到很好的纠正作用。一方面，对不同用量血浆和血清样本进行的检测结果有较高的相关性，表明在一定的范围内，其定量结果并不受到血浆血清用量的影响;另一方面，针对经过稀释后的原浓度的50%、10%甚至1%的血液循环DNA样品进行定量检测，理论上，无论经过多少倍稀释，样品中p-actin基因和重组质粒DNA内参照物的含量比值不会改变，经实验证实，其检测结果与原浓度样品相符，依然可以进行较为准确稳定的定量分析。无论是提取过程中核酸的丢失，还是样品长期保存过程中核酸的降解，甚至PCR反应时模板加入量的误差，由于内参照重组质粒DNA的存在，最终的定量结果能够反映核酸提取以前血液循环中DNA的真实水平。
4 结论
本文通过内参照物的设立，对定量检测研究中的各个步骤进行质量控制，这种稳定可靠的检侧方法有望应用于大样本回顾性调查以及临床检测。
参考文献
[1] 屠红,高海峰,傅士龙,等.肿瘤患者循环DNA的定量研究[J].中华肿瘤杂志,2004,26(10):606-608.
[2] 严子禾,潘世扬,陈丹,等.4种血装游离DNA提取方法的比较[J].临床检验杂志,2006,24:363-365.
[3] 赵建勤,刘丽.HBV—DNA定量与乙肝病毒感染免疫学检测结果对比分析及意义[J].华西医学,2001,16(3):332-334.
