高精度血液循环DNA定量检测研究

　　[摘要]  目的  建立血液循环DNA定量检测方法。方法  针对不同的血浆血清用量进行定量检测，确定该方法的敏感性。结果  最低可对2μl血浆或血清样本进行定量测定。血浆DNA定量检测结果与紫外分光光度法比较，检测差异低于20%，血清检测差异低于30%。结论  该方法特异性强、敏感性和准确性高、重复性好，检测准确性受各种干扰因素的影响较小。
　　[关键词]  血浆；血清；DNA定量检测

　　血液循环DNA作为一种微创性检测指标，越来越受到人们的关注，其含量在恶性肿瘤、产前疾病、感染性疾病和外伤等多种人类疾病中显著升高，在诊断、疗效观察和预后判断中具有重要的临床意义。目前有多种方法对血液循环DNA进行定量检测，其中，实时荧光定量PCR法以其高敏感性和无产物污染等优点而被广泛用于血液循环DNA定量检测研究。然而，由于血液循环DNA定量检测过程中的各个环节都存在着影响循环DNA含量检测准确性的因素，包括血液采集、分离、保存方式和样本选择的不同，以及血液循环DNA提取、纯化和定量方法的差异，造成各研究结果间缺乏可比性；另一方面，由于长期保存过程中核酸物质的降解，定量检测结果往往无法确定循环血液中DNA的真实水平。针对上述问题，本文通过人类基因无同源性的、大小接近3kb的内参照物，在分离制备血浆血清样本后立即加入此内参照物，与血液循环DNA同时进行提取纯化，并在同一个PCR反应管中同步扩增检测，建立了一个准确性高、干扰因素小的血液循环DNA定量检测方法，以期此技术最终能在临床上推广应用。

　　1  材料与方法
　　选取5名健康成年人，年龄25～30岁，每人分别采集15ml外周静脉血，其中，10ml采用EDTA-及抗凝，5ml置于干燥玻璃管中室温放置30min促凝。血浆血清标本的分离：抗凝及促凝静脉血1800g室温水平离心10min，吸取上清液于1.5ml离心管中，再17000g4℃离心10min，吸取上层无细胞血浆或血清200μl，所有操作在静脉血采集后1h内完成。
　　DNA内参照的制备：1)人工双链DNA的合成，将人工设计的两条互补寡核苷酸分别用Tris-EDTA缓冲液稀释为20μmol/L，等体积混匀，置100℃沸水浴中10min，再放于室温自然冷却。两条互补寡核苷酸与其反应产物在20%聚丙烯酰胺凝胶中于1XTBE(90mmol/L)缓冲液中150V电泳2h，凝胶在含EB的TBE缓冲液中染色20min后，在紫外灯下验证结果。2)将人工双链DNA重组至质粒载体，反应液混匀后在PCR扩增仪上16℃反应12h。3)感受态细胞的制备，取DH5a感受态细胞接种于含5mlLB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜；取0.2ml过夜培养物转种于含20mlLB培养基的锥形瓶中，37℃培养3h，2h时开始监测，每20min测一次，至600nm处的吸光度值在0.30～0.55之间；将5ml培养物倒入离心管，冰浴10min，再4000rpm4℃离心5min，弃去上清液(于吸水纸上倒置10s);将菌悬浮于5ml冰冷的0.1mollL的CaCl2中，4℃，4000rpm离心10min，弃上清;将菌悬浮于1ml冰冷的0.1mol/L的CaCl2中0.2ml/管分装，4℃保存备用。将200μl新鲜制备的感受态细胞与10μl重组的质粒DNA混合均匀，冰浴30min，再置于42℃水浴中2min，立即置于冰上2min;加入0.8mlLB培养基，混匀，37℃摇床200rpm振荡培养1h。
　　DNA的提取：收集3ml经测序验证为含有带有41bp人工合成双链DNA序列阳性重组质粒DNA的克隆培养菌液，12000g室温离心1min;弃上清培养液，往沉淀中加入250μlSolution I/RNase A混和液，涡漩振荡重悬细胞；往重悬混和液中加入250μlSolution II，轻轻颠倒和旋转混匀试管4～6次混和溶液，避免剧烈混和，以获得澄清的裂解液，室温静置2min；往上述混和液中加入350μlSolution III，温和的上下颠倒离心管数次，直至形成白色絮状沉淀，室温下10000g离心10min；将HiBind小量制备柱套在2ml的收集管中，小心将上清液转移到柱子上(转移上清液时不要将细胞杂质等沉淀物转移到柱子中)，室温下10000g离心1min; 弃去滤出液，柱子重新套回收集管中，加入500μlHB缓冲液，室温下10000g离心1min;弃去滤出液，柱子重新套回收集管中，加入750μl洗涤缓冲液(已用无水乙醇稀释)，10000g离心1min;将柱子套在干净的1.5ml离心管中，加入60μlTE缓冲液至柱子基质，置65℃2min,10000g离心1min以洗脱DNA。实验数据均采用stata7.0软件进行分析。正交实验结果采用两因素方差分析;多组配对资料采配伍组设计的方差分析。

　　2  结果
　　2.1  检测方法的敏感性  当血浆DNA用量降低为1μl时，目的基因p-actin和重组质粒DNA的扩增均为阴性，已超出该方法的最低检测敏感限。当血浆或血清用量为200，100，50，10和2μl时，其定量检测结果具有较好的相关性，相关系数r分别为0.997和0.998。
　　2.2  检测方法的准确性  空白血浆和血清DNA平均浓度分别为73ng/ml和739ng/ml。通过紫外分光光度法检测从人白细胞中提取的DNA在260nm处的吸光度值，经过计算和梯度稀释，确定投入到空白血浆中的白细胞DNA量分别为2,10和20ng;投入到空白血清中的白细胞DNA量分别为10,20和200ng，采用双重实时荧光定量PCR方法的检测结果