β-榄香烯联合碘油栓塞对兔VX2肝癌凋亡、增殖的影响

β-榄香烯联合碘油栓塞对兔VX2肝癌凋亡、增殖的影响
戚晓军   王峰
［摘要］ 目的观察β-榄香烯，碘油不同给药方式对兔肝移植瘤残余肿瘤细胞凋亡、增殖的影响。 方法 34只家兔肝内肿瘤种植后2周经MRI检查证实后，随机分为对照组：A组（6只 生理盐水 2ml 10min）；治疗组：B组（7只 碘油单纯栓塞0.5ml 10min），C组（7只 β-榄香烯冲击灌注 50mg 10min），D组（7只 β-榄香烯持续灌注 50mg 5hour），E组（7只 碘油 0.5ml＋β-榄香烯50mg栓塞灌注 10min）5组。实验兔介入治疗后2周处死，取全部肿瘤组织，采用原位末端标记法检测肿瘤细胞的凋亡指数，免疫组化方法测定肿瘤细胞增殖细胞核抗原的表达。结果 各组的凋亡指数和增殖指数分别为1.63±0.24，2.35±0.73，1.94±0.28，2.41±0.40，3.50±0.54和77.3±5.9，57.1±6.8，73.4±6.7，63.0±9.6，38.0±5.0。两者存在负相关。结论1.β-榄香烯持续动脉灌注治疗效果好于一次性冲击灌注; 2.β-榄香烯碘油栓塞治疗比单纯碘油栓塞及β-榄香烯持续动脉灌注效果好，可以取得较高的凋亡指数和较低的增殖指数。3.促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖是肝动脉化疗栓塞术抗肿瘤作用的分子机制之一。
［关键词］榄香烯 肝肿瘤  VX2 肿瘤 凋亡 介入放射学

Effect of TACE with β-elemene and Lipiodol on Apoptosis and Proliferation of VX2 Carcinoma of Rabbits
QI Xiao-jun   WANG Feng

［Abstract］  Objective   To observe the effect of TACE with β-elemene and Lipiodol on Apoptosis and Proliferation of VX2 Carcinoma transplanted on Rabbit liver. Methods: Thirty-four New Zealand White rabbits were  transplanted with VX2 carcinoma on the left lobes of the livers . Two weeks later , 34 rabbits were randomly divided into 5 groups, A group(injection of 2ml normal saline for 10 minutes), B group(0.5ml lipiodol via hepatic artery for 10minutes), C group(β-elemene 50mg one-shot or bolus injection for 10 minutes), D group(β-elemene 50mg continuous transarterial infusion for 5hours), E group(β-elemene 50mg+lipiodol 0.5ml embolization for 10 minutes). The apoptotic index , proliferation index  in survival tumor tissue were examined 2 weeks after treatment by TUNEL (in situ nick end-labeling) method and immunohistochemistry with anti-PCNA monoclonal antibody respectively. Results:　Apoptotic  index  of  survival  tumor cells was 1.63±0.24，2.35±0.73 , 1.94±0.28，2.41±0.40，3.50±0.54, and proliferation index was 77.3±5.9，57.1±6.8，73.4±6.7，63.0±9.6，38.0±5.0  in each group respectively. Conclusion: 1. The effect of persistent β-elemene arterial infusion was better than that of a one-time infusion. 2.β-elemene chemoembolization combined with lipiodol can get a higher index of apoptosis and a lower index of proliferation than single lipiodol andβ-elemene continuous infusion. 3. Inducing tumor cell apoptosis and inhibiting tumor cell proliferation are one of the molecular mechanisms of TACE for antitumor effect.
［Key words］: β-elemene, Liver neoplasms, Apopotosis, Proliferating, cell nuclear antigen, Interventional Radiology

原发性肝癌是我国的常见肿瘤，而且近年来发病率逐年上升。由于原发性肝癌起病隐匿，患者就诊时大多已属中、晚期，再加上合并肝硬化率高及手术后复发率高等多种因素，手术切除率很低。为此，绝大部分肝癌患者需非手术治疗。而肝动脉化疗栓塞术(Transcatheter artery chemoembolization,TACE)成为非手术治疗中的首选。因此对TACE的基础研究就显得迫在眉睫。其中动物疾病模型的复制为TACE研究提供了平台，而兔Vx-2移植性肝癌模型虽然不是肝细胞癌，但其在病理学上类似于人类巨块型肝癌产生与临床肝癌相似的治疗反应与变化，比较适合影像诊断及治疗性研究。
β-榄香烯是我国自行开发的国家二类抗肿瘤新药，对体内外多种肿瘤细胞具有较强的抑制和杀伤效应。但目前对β-榄香烯动脉应用治疗肝癌的机理研究比较少，因此本研究致力于采用β-榄香烯，碘油不同给药方式治疗兔VX2移植性肝癌，观察各种治疗方式对残余肿瘤细胞凋亡、增殖的影响，从而为临床选择高效的用药方式提供理论依据。

资料与方法
1 实验材料与仪器：
1.1  实验动物 新西兰大白兔39只，体质量2.0~2.5kg，雌雄不限，4-5月龄，由大连医科大学动物实验中心提供。
1.2  瘤块来源 荷VX2瘤种兔4只，由解放军301医院动物研究所提供。
1.3  药物 超液态碘油(10毫升/支 法国加柏公司)；β-榄香烯乳剂（100mg/20ml/只 大连远大制药有限公司）。
1.4  SP微导管（日本TERUMO公司），荷兰PHILIPS HM 3000 C型臂数字减影机。
2 方法：
2.1  VX2肝癌模型制作
取荷瘤种兔大腿深部肌肉内VX2瘤，剪取肿瘤边缘生长旺盛组织制成1×1×1mm3的小组织块备用，按30mg/kg经兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠麻醉，暴露肝脏后于肝左叶包埋瘤粒，明胶海绵压迫片刻回纳肝脏，按腹膜肌肉皮肤三层缝合,前两层用间断缝合。整个过程30min内完成。
2.2  MR检查
使用GE公司的SIGNA EXCITE 1.5T超导磁共振。种植两周后对部分实验兔行常规MR检查。
2.3  荷瘤动物分组
经MRI证实荷瘤兔34只随机分为对照组：A组（6只 生理盐水 2ml 10min）治疗组：B组（7只 0.5ml碘油单纯栓塞），C组（7只 β-榄香烯冲击灌注50mg，10min），D组（7只 β-榄香烯持续灌注50mg/kg，5hour），E组（7只碘油0.5ml＋β-榄香烯50mg栓塞灌注 10min）。
2.4  兔VX-2肝肿瘤模型的介入插管治疗
介入治疗时间选择在接种后2周进行，插管方法模拟人肝动脉插管介入治疗的方法。实验兔按上述方法麻醉后，分离右股动脉，用眼科剪剪一斜行小口，置入SP导管。用导丝在T12和L1椎体水平腹主动脉右前壁寻找腹腔动脉开口，试推造影剂证实后，将SP导管送入肝固有动脉内，按照分组情况行介入治疗，术毕结扎右股动脉，明确无明显渗血后，逐层缝合。
2.5  观察内容
2.5.1  凋亡指数测定：
全部实验兔介入术后2周处死，兔处死后立即取肿瘤外带非坏死区域
0. 5cm ×0. 5cm ×0. 5cm 肿瘤块组织，10%福尔马林固定，石蜡包埋，采用DNA 缺口末端标记( TUNEL)法检测肿瘤组织中的凋亡细胞，凋亡细胞的判断标准为:散在分布,胞核或胞核和胞质同时呈棕黄色,有典型凋亡形态特征,包括与周围细胞分离、胞体变小、染色体浓缩、核碎裂或染色质沿核膜呈规则半月形边集或凋亡小体形成,即为凋亡细胞。高倍镜下在肿瘤组织随机选择5个视野计数1000个肿瘤细胞,其中阳性细胞所占百分比即为凋亡指数(A I) 。
2.5.2  增殖指数测定：
PCNA表达结果的测定，抗体的稀释度为1：100，每例随机选取5个高倍( ×400)视野计数1000个细胞, 胞核有棕黄色或棕褐色颗粒沉积者为阳性染色，其中阳性细胞所占百分比即为细胞增殖指数( P I) 。为消除内源性过氧化物酶引起的非特异性着色，采用PowerVisionTM二步法免疫组化检测。
3  统计学处理
所有数据表达采用均数±标准差的方式表示，各组数据之间比较采用t检验、方差分析及χ2分析，统计学分析使用SPSS10.0统计软件，P<0.05有显著统计学意义。

结果
1．模型建立情况
1只由于麻醉意外而死亡。2只实验兔粪质呈浓液样，于第7、9天相继死亡。 2只行MRI及DSA检查未见明确肿瘤征象。实验兔39只，成功建立肝癌模型34只。建模成功率为94.4％(34/36)。
2．MR检查
MR平扫T1WI见肿瘤组织呈低信号，T2WI上呈略高信号影，DWI上呈高信号影（图1）。肿瘤位置与种植位置吻合，肿块大小平均为1.2cm×1.0cm×1.0cm。未见明确肝内转移。 
3．介入治疗
肝动脉造影可见兔腹腔动脉自腹主动脉发出后分为二支，中央斜行向上者为肝胃动脉，向右者为胃脾动脉。肝内肿瘤实质期染色明显(图2)，供应肿瘤动脉不规则、紊乱，迂曲。介入治疗后碘油沉积于瘤区较周边正常肝组织明显。
4．肿瘤细胞PCNA的表达及凋亡指数　
兔肝肿瘤经肝动脉治疗后各组肿瘤细胞凋亡指数及增殖指数见表1。非栓塞组可见散在的凋亡细胞(图3) ,栓塞治疗组凋亡细胞增加(图4) , 观察切片后可以发现凋亡细胞主要位于肿瘤的周边，散在分布，中心以坏死细胞为主。增生细胞核抗原染色阳性细胞呈弥漫或片状分布,非栓塞治疗组增生细胞核抗原染色阳性细胞多见(图5) ,单纯碘油栓塞及β-榄香烯碘油栓塞组肿瘤细胞的增生指数下降,但部分细胞增生细胞核抗原表达强度增加,细胞染色加深(图6) 。β-榄香烯一次性灌注和持续灌注组肿瘤细胞的增殖指数下降，但不如碘油组明显，差异具有显著性。
讨论
  　β-榄香烯(β-elemene) 是从中药温莪术根茎提取的有效单体，是榄香烯抗肿瘤三种有效成分之一[1] 。多种体内和体外实验研究[2~6]表明：β-榄香烯(β-elemene)的主要抗肿瘤机制表现为可诱导肿瘤细胞凋亡；干扰肿瘤细胞生长代谢途径，阻碍肿瘤细胞从S 期进入G2/M 期；对肿瘤细胞的DNA、RNA和蛋白质的合成代谢有抑制作用，且存在浓度与时间依赖性。本实验通过建立兔VX2 肝癌模型，在此基础上采用β-榄香烯加碘油不同的给药方式及给药持续时间研究β-榄香烯对肝癌细胞凋亡、增殖能力的影响。
β-榄香烯治疗实体瘤经静脉途径给药，难以使肿瘤局部药物达到有效浓度。经肝动脉灌注栓塞治疗，β-榄香烯随栓塞的碘油沉积于肿瘤局部，并在碘油中缓慢释放，可使肿瘤局部保持β-榄香烯的有效浓度，持续较长时间，有助于发挥其抗肿瘤效应，符合β-榄香烯的作用具有时间及浓度依赖性的特点，并可使全身循环药物浓度保持在低水平，降低其不良反应的发生。
肝动脉化疗栓塞术（TACE）是目前公认的非手术治疗原发性肝癌的主要方法，通过选择性阻断肝癌的动脉血供发挥抗癌作用，有研究认为化疗栓塞除引起肿瘤细胞缺血坏死外, 还可通过影响凋亡相关基因发挥诱导肿瘤细胞凋亡作用[ 7,8 ]，同时抑制残余肿瘤细胞的增殖能力。而且诱发肝癌细胞凋亡作用较手术切除有明显差异[ 9 ]。本实验同时观察了不同给药方式对肝癌细胞凋亡及增殖的影响。
既往的研究认为TACE诱导肝癌细胞凋亡的途径有 : 1) TACE通过上调Bax蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达及Bc1-2和Bax蛋白表达比值使肝癌发生凋亡[ 10 ]；2) 细胞凋亡是大多数抗肿瘤药共同作用通道，与栓塞剂合用的化疗药物或通过损伤DNA 诱导凋亡，或使促凋亡基因表达增高，或使凋亡抑制基因失活不表达, 从而使凋亡增加[ 11 ] ；3) TACE可引起肿瘤区缺血，缺氧。缺血是强有力的基因诱导动因。缺氧也可诱导促凋亡基因表达增高[ 12 ]；4)TACE所引起的浸润淋巴细胞及其表达的肿瘤坏死因子也可诱导细胞凋亡[ 13 ] 。细胞凋亡发生后产生典型的形态学改变[ 14 ]：早期表现为内质网和细胞膜上出现一些小泡，细胞体积缩小，胞膜皱缩，但其细胞内膜结构尚完整，没有细胞内溶物的释放，与细胞坏死过程中出现的自溶现象截然不同；中期细胞核发生固缩，染色质浓缩边集，形成由膜状物包裹内溶物的小体，称之为凋亡小体。故凋亡是评估药物疗效的一项重要指标，同时肿瘤细胞凋亡和增殖的比例决定肿瘤的生长速度。因此诱导并调控细胞凋亡成为肿瘤治疗的热点之一。
肿瘤生长不仅是病变体积增长，更重要的是细胞增殖活性发生变化，增殖活性是了解肿瘤生物学行为有效的辅助手段。PCNA是一种分子质量为36 kD的核蛋白，为DNA多聚酶δ的辅酶。作为一个内源性增殖细胞的标记物，PCNA与癌组织的增殖活性、转移及预后关系密切[15 ] 。单因素和多因素分析显示PCNA高表达可导致肿瘤更具侵袭性、更易复发、预后更差[16~18]。在本实验中，我们将增殖指数和凋亡指数结合起来分析，将更全面地判断各种药物及给药方式对肿瘤细胞生长状态的影响，为临床选择高效的用药方式提供理论依据。
我们的结果显示，榄香烯碘油栓塞组诱导的肿瘤细胞凋亡比率明显高于其它各组，增殖指数则显著低于其它各组，差异显著（P<0.05）。这一点和临床应用结果相吻合。分析其原因考虑榄香烯与碘油具有协同作用，与其对肿瘤进行的双重促凋亡，抑增殖有关，从而产生1＋1＞2的效应。β-榄香烯还可以刺激肿瘤血管，使其内膜增厚，发生血管炎，促使血栓形成，使栓塞后未完全闭塞的血管进一步闭塞，增加肿瘤的坏死率，增加诱导凋亡的发生率，从而加强其抗肿瘤效果。对照组经动脉灌注生理盐水，发生的凋亡率较低，代表VX2 肝肿瘤的自然凋亡水平较低。从以上结果我们可以看出，治疗组增殖指数显著低于对照组增殖指数，而细胞凋亡指数则正好与此相反，两者维持着动态平衡，表明介入治疗后肿瘤细胞的生长明显受到抑制，凋亡程度明显提高。因此我们认为抑制肿瘤细胞增殖和诱导其凋亡是介入治疗肝癌的分子机制之一。
β-榄香烯属周期特异性药物，对肿瘤的杀伤作用需要有效的浓度和持续的作用时间。Taguchi等[19]把VX2肿瘤植入兔的后肢建立肿瘤模型，将导管插入主动脉内以周期特异性抗肿瘤药阿霉素（ADM）2mg/kg的剂量连续灌注和一次性灌注对比，结果经动脉一次性注药后，末梢血中ADM几分钟即达到高峰，而后迅速下降。经动脉连续灌注1h则ADM浓度逐渐升高，60min时达到峰浓度，再迅速降低，说明经动脉连续灌注优于一次性灌注。同时测定肿瘤组织药物浓度发现，经动脉连续灌注组最高。在本研究中，我们也发现β-榄香烯持续性灌注与一次性冲击灌注相比，具有更高的凋亡指数和较低的增殖指数，差异具有显著性（P<0.05），同Taguchi研究结果具有一致性。
β-榄香烯持续灌注组同碘油组相比，未见显著性差异（P>0.05），考虑原因为本实验样本数较少，以及观察时间较短等，但也不排除本身各两组间就不存在差异的可能性。如不存在差异，则β-榄香烯对肝功能的损害远远小于碘油栓塞，则提示对肝功欠佳的肝癌病人应用β-榄香烯有广阔的应用前景。因此我们希望在以后的实验中能进一步完善实验设计，加大样本数量，并选择耐受性好，预计生存期长的兔子做模型进行研究。
β-榄香烯一次性灌注组同碘油组相比，差异具有显著性（P<0.05），反映了碘油栓塞的效果好于单纯药物灌注的效果，这点同临床的结果是相符合的。
总之，β-榄香烯联合碘油栓塞治疗后残余肿瘤的凋亡增加，肿瘤细胞的增殖能力下降，也进一步印证β-榄香烯主要通过诱导肿瘤细胞的凋亡发挥其抗肿瘤作用。因此临床应大力推广β-榄香烯联合碘油栓塞治疗肝癌。

             
            T2WI见高信号影                                                        3F管超选至腹腔干可见肝动脉及胃肠动脉，肝左叶可见肿瘤染色                                  
           图1                                                                                            图2
表1　经肝动脉治疗后2周兔肝肿瘤细胞凋亡指数及增殖指数

分组 n AI(%) PI(%)
A组
B组
C组
D组
E组 6
7
7
7
7 1.63±0.24
2.35±0.73*
1.94±0.28*
2.41±0.40* #
3.50±0.54* 77.3±5.9
57.1±6.8*
73.4±6.7*
63.0±9.6*#
38.0±5.0*
注: * P < 0. 05 vs A组;  # P < 0. 05 vs C组; P<0.05E vs B D C; P>0.05Dvs B; P<0.05 Cvs B

              
生理盐水组自然凋亡                                                                         榄香烯碘油栓塞组凋亡细胞增多
图3                                                                                                            图4

          
生理盐水对照组PCNA染色增强                                                     E组PCNA染色细胞减少
图5                                                                                                               图6

参考文献

[1]时继慧. 温莪术挥发油的实验药理研究β—榄香烯抗肿瘤作用的研究[J]. 中药通报, 1981,6(6): 32.
[2]郝立宏,卢步峰,于丽敏,等.β-榄香烯与阿霉素联合应用对CEM/APM细胞生长的影响[J]. 大连医科大学学报, 2000, 22(3):12.
[3]施广霞,于丽华,刘金友,等.β-榄香烯抗肺癌作用实验研究[J]. 大连医学院学报,1994, 6(2):137.
[4]袁静,顾振纶,周文轩,等. 榄香烯诱导人白血病K562细胞凋亡[J]. 中国药理学通报, 1998, 14(5):410-412.
[5]陈龙帮,王靖华,藏静,等.β-榄香烯诱导小鼠黑色素瘤B16细胞凋亡的研究[J]. 金陵医院学报,1999, (2):12-22.
[6]袁静,顾振纶. 榄香烯诱导K562 细胞凋亡的流式细胞术分析[J]. 实用肿瘤杂志,1998 , (6) :343 - 344.
[7]蒋飚,楼琦,丁信法,等. 碘油栓塞致大鼠肝肿瘤细胞凋亡和动态病理观察[J]. 中华肿瘤杂志, 2004, 26 (4) : 205 - 208.
[8]肖恩华,胡国栋,刘鹏程,等. 化疗栓塞后肝细胞癌细胞凋亡的研究[J]. 中华放射学杂志, 1999, 33 (3) : 153 - 155.
[9]宁厚法,王滨,曹贵文等.肝动脉栓塞化疗术对肝细胞癌bcl-2、fas和bcl-xl表达的影响[J].临床放射学杂志,2004,23(4) :324-327.
[10]肖恩华,刘辉,罗建光,等.术前经动脉化疗栓塞对肝细胞癌细胞凋亡的影响[J]. 临床放射学杂志,2003,22(7):578-581.
[11]Park IC，Park MJ，Hwang CS．et a1．Mitomycin C induces apoptosis in a caspases dependent an Fas／CD95-independent manner in human gastric denecarcinoma cells [J]．Cancer Letters, 2000, 158(2): 125.
[12]An W G，Kanekal M ，Simon MC，et a1．Stabilization of wild-type p53 by Hypoxia-inducile factor la [J]．Nature，1998，392(6674)：405-408.
[13]Seraldi G，Shaklee CI，Simon B，et a1．Keratinocyte growth factor protects murine hepatocytes from tumor necrosis factor induced apoptosis in vivo and in vitro [J]．Hepatology，1998，27(6)：1584-1591.
[14]Kerr  JFR, Hamon BV. Apoptosis: Its significance in cancer and cancer therapy [J].Cancer, 1994, 73(8):2013-2026.
[15]lgarashi N，Takahashi M ，Ohkubo H，et a1．Predictive value of Ki-67．p53 protein．and DNA content in the diagnosis of gastric carcinoma [J]．Cancer，1999，86(8)：1449-1454．
[16]Fukuse T，Hirata T，Naiki H，et a1．Expression of proliferating cell nuclear antigen and CD44 variant isoforms in the primary and metastatic sites of non--small cell lung carcinoma with intrapul--monary metastases [J]．Cancer，1999，86(7)：1174-1181
[17]Kitamoto M ，Nakanishi T，Kirz S，et a1．The assessment of proliferating cell nuclear antigen immunohistochemical staining in small hepatocellular carcinoma and its relationship to histological characteristics and prognosis [J]．Cancer，1993，72(6)：1859-1865．
[18]Li JQ，Zhang CQ，Zhang YQ，et a1．Immunohistochemical study of PCNA and p53 in primary liver cancer：An implication for prognosis and treatment [J]．J Exp Clin Cancer Res，1996，15(?)：77-82．
[19]Taguchi T, et al. Attain ability of anticancer drugs into the tumor [J]. Jpn J Cancer Clin, 1979, 25(?): 782