吉西他滨与顺铂对人胆管癌细胞放射增敏作用的比较实验研究

[摘要]目的 比较吉西他滨和顺铂对人胆管癌细胞放射增敏作用的差异。方法 取指数生长期的人胆管癌细胞系（QBC939），采用细胞克隆形成分析法分别检测吉西他滨和顺铂的单药毒性，确定半数抑制药物浓度（IC50）作为下一步实验的药物浓度。将QBC939细胞分为对照组、单纯药物组、单纯照射组及联合治疗组。单纯药物组、联合治疗组分别分为吉西他滨亚组和顺铂亚组。X射线照射剂量为0Gy、1Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy，采用多靶单击数学模型拟合细胞存活曲线，放射增敏比(SER)为达到相同之处生物效应时,单纯照射的剂量与联合治疗组的剂量之比。结果 吉西他滨对QBC939细胞的IC50为11.0nM/L，顺铂对QBC939细胞的IC50为0.4µM/L。以D0为标准计算放射增敏比,吉西他滨的SERD0分别2.64，顺铂的SERD0分别1.01。结论 吉西他滨较顺铂对QBC939细胞具有更强的增敏作用。

【关键词】胆管癌；放射增敏；吉西他滨；顺铂

[Abstract] Objective To evaluate the radiation sensitizing enhancement effect of gemcitabine and cisplatain in human cholangiocarcinoma cells (QBC939) in vitro. Methods The cytotoxicity was determined by clonogenic assay. The cells were divided into four groups: control group, chemotherapy group, radiation group, combined therapy group. The radiation dose ranged from 1 Gy to 10 Gy. The cells survival curves were fit using two-component equation and Sensitive Enhancement Ratio (SER) were calculated. Results  The IC50 of gemcitabine and cisplatin for QBC939 cells were 0.1nM/L and 0.4µM/L, respectively. The SERD0 induced by gemcitabine is 2.6 and by is 1.01 cisplatin. Conclusion  On the basis of an optimal scheduling, the radiosensitizing of gemcitabine is more obvious than cisplation in QBC939 cells

[Key words] Cholangiocarcinoma; Radiosensitization; Gemcitabine; Cisplatin

胆管癌发病隐匿，发病时大多属晚期，手术切除率低，对于无法手术切除或切除后边缘阳性的病人，放化疗联合治疗越来越受到大家的重视，尤其是化学药物治疗对于放射治疗的增敏作用引起了广泛的关注。

顺铂、5-FU在胆管癌化学治疗上被广泛应用，并具有一定的放射增敏作用。吉西他滨（健择，Gemcitabine）是一种较新型的脱氧胞苷类似物，对于胰腺癌和非小细胞肺癌的作用已被大家所公认，成为一线用药，近年来被逐步应用到其他肿瘤的治疗中，有报道临床应用吉西他滨联合放射治疗胆管癌总体缓解率高于顺铂等传统药物。本实验从细胞水平
探讨吉西他滨对人胆管癌细胞的放射增敏作用，并以顺铂作为对比，为吉西他滨在胆管癌治疗的合理运用提供实验室参考依据。

材料与方法

1．细胞培养和药物
胆管癌细胞系QBC939由第三军医大学附属西南医院王曙光教授惠赠。细胞单层贴壁生长，使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养液，培养液中加入100U/ml的青霉素和链霉素，用指数生长期的细胞进行实验。
吉西他滨（Gemcitabin，健择）由法国礼来公司生产，原药为200mg/瓶，分子量为300.01，常温保存。实验前用生理盐水将原药稀释至40mg/ml，然后用培养液逐级稀释到所需实验浓度。
顺铂注射液（Cisplatin Injection）由澳大利亚科鼎有限公司生产，原药为50mg/50ml，分子量为303.1，常温保存。实验前用培养液逐级稀释到所需实验浓度。

2．照射条件和方法 
采用直线加速器（Varian 600C，美国）产生的6MV-X射线进行不同剂量照射，剂量率250cGy/min，放射源与等效蜡板表面距离为100cm，室温下照射。

3. 实验内容及分组
3．1　药物毒性实验 
根据文献初步估计药物毒性实验的药物浓度，设立10个阶梯浓度，每组3个培养瓶。将胆管癌细胞单细胞悬液接种贴壁后加入含不同药物浓度的吉西他滨或顺铂培养液，作用24小时后弃去药液，用新鲜培养液洗涤2次，继续培养10-12天后染色计数，绘制药物毒性曲线，确定50％的抑制浓度(IC50)。
3.2 　实验分组　
将QBC939细胞分为对照组、单纯药物组、单纯照射组及联合治疗组。其中单纯药物组、联合治疗组分别分为吉西他滨亚组和顺铂亚组。

4．实验方法及观察指标 
药物毒性及放射增敏实验的指标是克隆源细胞存活分数。采用细胞克隆形成分析法分析吉西他滨和顺铂对胆管癌细胞的放射增敏作用。主要实验步骤：采用指数生长期的胆管癌细胞，经0.25%的胰酶消化后制成单细胞悬液，然后依照射剂量的不同将不同数量的细胞分别接种到相应的培养瓶中，根据实验设计于照射前给IC50浓度的健择或顺伯，作用24h后换液进行不同剂量的照射，X射线照射剂量为0Gy、1Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy。在CO2孵箱内培养10－12天后，无水酒精固定，结晶紫染色，计数≥50个细胞的克隆，计算细胞存活分数 (细胞存活分数=实验组细胞贴瓶率（PE）/对照组细胞贴瓶率(PE)，贴瓶率(PE)=细胞克隆数/接种细胞数)，并绘制细胞存活曲线。实验数据采用“多靶单击”数学模型拟合（S=1-（1-eD/Do）•N），求出D0（细胞存活曲线的直线部分使细胞存活从0.1下降到0.037所需要的剂量）、Dq（将细胞存活曲线的直线部分延长,与通过存活率为1 的横轴相交点的计量值）、SF2（单次照射2Gy的存活分数）和N(外推数)，计算放射增敏比(放射增敏比SER D0 的定义为在达到相同之处生物效应时,单纯照射的剂量与药物加照射组的剂量之比)。

结  果
1 吉西他滨和顺铂的药物毒性：
实验结果显示随药物浓度增加细胞毒性增加呈剂量依赖性。吉西他滨和顺铂对QBC939细胞的IC50分别为11.0nM/L和0.4µM/L。
2 IC50吉西他滨或顺铂的放射增敏作用
实验结果显示在吉西他滨为IC50（11.0nM/L）的浓度下在照射前作用24小时Dq值、SF2值和D0值明显低于单纯照射组，表明有较强的增敏作用；以D0为标准计算放射增敏比,吉西他滨的SERD0为2.64（细胞生存曲线见图1）。
实验结果显示在顺铂为IC50（0.4µM/L）的浓度下Dq和SF2值均低于单纯照射组，表明两组在低剂量区有一定放射增敏作用，而D0值略低于单纯照射组，表明在高剂量区具有一定的放射增敏作用；以D0为标准计算放射增敏比,顺铂的SERD0为1.26（细胞生存曲线见图1）。
吉西他滨较顺铂对QBC939细胞放射增敏比高。

讨   论：
胆管癌早期多无明显的临床症状，多因黄疸就诊，手术是肝外胆管癌的主要治疗手段，但就诊时仅10-40%患者可以行手术[1,2]。对于大多数不能手术切除的患者，多行引流管或金属支架置入进行姑息治疗。尽管经上述治疗可以一定程度的缓解梗阻性黄疸，改善症状，提高生存质量，减缓肝功能的损坏，但是胆管的通畅为暂时性的，不能根本解决肿瘤问题。Shinchi[3]等的研究显示接受胆道支架和放射治疗组的中位生存期和胆道通畅时间显著优于单纯支架置入组（10.6月vs 6.4月，P<0.05；9.8月vs 3.7月，P<0.001）。Bowling[4]和 Kamada[5]等的研究也证实放射治疗不但可以延长胆道的通畅时间，也可增加患者的中位生存时间。但是即便接收放射治疗，还是有部分患者出现局部区域的复发。同步放化疗是目前正在进行广泛临床研究的一种新的治疗模式，在多种晚期肿瘤治疗中证明同步放化疗与单纯放射治疗相比，不仅可以提高局部控制率，还可以增加生存率。文献报道5-FU、顺铂等无论在动物实验还是人体试验中均证明可以增加胆管癌对放射治疗的敏感性，因而作为放疗增敏剂被广泛应用于胆管癌放化疗中，临床应用中5－FU和顺铂对胆管癌的缓解率在20％～40％[6-8]。

吉西他滨是一种核苷类似物,为细胞周期特异性抗代谢类药物，在细胞内经核苷激酶作用转为有活性的二磷酸( dFCDP) 及三磷酸核苷(dFdCTP) ，进而抑制DNA 链继续延长,从而导致细胞死亡[9,10]。吉西他滨对胰腺癌和非小细胞肺癌放射治疗的增敏作用在临床上已得到证实，但对胆管癌是否具有同样的放射增敏作用目前尚无文献报道。
细胞存活曲线上D0是在剂量效应曲线的的直线部分把存活率从0.1降至0.037所需的剂量，D0的大小反映了细胞的辐射敏感性。它反映每种细胞在相对高剂量区对射线的敏感性，D0值越大，细胞对射线越抵抗。同一种细胞D0值的改变标志着细胞放射敏感性的变化。在本实验中，健择组D0值明显的小于顺铂组，说明健择增加了细胞对射线敏感性，其放射增敏比为2.64。准阈剂量Dq是测量生存曲线肩宽的参数，它是存活曲线的直线部分向上延伸与通过存活率等于1的横轴相交点的剂量。它表明细胞亚致死损伤修复能力的大小。Dq值越小，表明细胞对亚致死损伤修复能力较弱，很小剂量便可使细胞进入致死损伤，从细胞存活曲线参数也显示吉西他滨使细胞存活曲线的Dq值明显变小，且小于顺铂组Dq值，表明吉西他滨较顺铂能更有效地抑制细胞亚致死性损伤修复，这也可能是其放射增敏作用的原因之一。

本实验结果显示吉西他滨比顺铂对体外培养的胆管癌细胞具有更明显的放射增敏作用，为吉西他滨在临床的合理应用提供了实验室参考依据。

参考文献
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表1  IC50吉西他滨和顺铂联合放射线照射胆管癌细胞的存活曲线参数

表注：RT---单纯照射组
Gem+RT ---健择作用24小时+照射组
DDP+RT ---顺铂作用24小时+照射组