β－榄香烯对HepG2和HT-29细胞体外抗癌作用的实验研究

[摘要]  目的  探讨β-榄香烯对肝癌和结肠癌的作用，为临床上利用β-榄香烯治疗肿瘤提供理论依据。方法  体外培养HepG2肝癌细胞和HT-29结肠癌细胞，用生长曲线和MTT法观察β-榄香烯对两种细胞生长的影响。结果  β-榄香烯组在培养的第6d、第7d、第8d能显著抑制HT-29细胞增殖；β-榄香烯在培养的第6d能显著抑制HepG2细胞增殖；在第2d、在第3d、在第4d，与对照组相比，β-榄香烯对HT-29和HepG2细胞增殖的抑制作用显著(P<0.05)。结论  β-榄香烯能明显抑制体外培养的HT-29和HepG2细胞生长。
[关键词]  β-榄香烯；HepG2细胞；HT-29细胞

[Abstract]  Objective To explore the β-elemene on liver cancer and colon cancer in order to provide a theoretical basis for the clinical application.Methods Proliferation of HepG2 cell and HT-29 cell in vitro were observed withβ-elemene by the means of growth curve modeling and MTT assay.Results β-elemene group in the sixth, seventh, eighth day, the can significantly Inhibit the HT-29 cells proliferation; the β-elemene group in the sixth day can significantly Inhibit the HepG2 cells proliferation; in the second day, third and fourth day, compared with the control group, the β-elemene group has significantly Inhibit the HT-29 and HepG2 cells proliferation. Conclusion β-elemene could inhibit the HT-29 and HepG2 cells growth in vitro.
[Key words]  β-elemene; HepG2 cells; HT-29 cells

β-榄香烯是由碳、氢两种元素组成的倍半萜烯类化合物，药理学及临床研究证明β-榄香烯是一种疗效确切的非细胞毒性抗肿瘤药物，具有良好的抗癌活性，且其抗癌作用还有一定的特异性[1]。目前β-榄香烯作为一种新型的抗癌药物正发挥着越来越重要的作用，其临床应用越来越受到重视，主要用于治疗颅内肿瘤、治疗呼吸道肿瘤、胃癌等。肝癌和结肠癌都属于实体肿瘤，在其肿瘤的发生中，血管的生成十分重要。如果药物能对肝癌和结肠癌细胞发挥诱导凋亡和抑制血管生成作用，则具有抗肿瘤活性。而目前有关β-榄香烯治疗肝癌和结肠癌目前尚未见报道，因此本实验通过β-榄香烯对肝癌HepG2细胞和结肠癌HT-29细胞生长的影响，探讨β-榄香烯的抗癌作用，为临床上利用β-榄香烯治疗肿瘤提供理论依据。
1  材料与方法
1.1  细胞株：细胞株为来源于人的肝癌细胞株HepG2和结肠癌细胞株HT-29，购自中国科学院上海细胞生物研究所。
1.2  药品与仪器  药品：β-榄香烯乳注射液(大连金港制药有限公司)，试剂为分析纯。主要仪器：550型酶标仪(BIO-RAD公司)、XDS-1B倒置显微镜(重庆光学仪器厂)、SW-CJ-2F超净化工作台(苏州净化设备有限公司)、2306-2二氧化碳孵箱(SHELLAB公司)、984型低温冰箱(Forma公司)等。
1.3  方法 在37℃、5%CO2条件下，用含10%FBS的低糖DMEM培养HepG2和HT-29细胞。将培养2d的HepG2和HT-29细胞经0.25%的胰酶消化，制成1×104/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，各240孔，每孔200μl。将β-榄香烯加入孔中，使其终浓度分别为27μg/ml，27μg/ml，10μg/ml；另设置一个不加药物的对照组。以接种细胞的当天为0d，分别于1～8d取每个组的细胞，按照常规方法进行记数。在计数过程中，每隔2d换一次培养液，换液后维持药物浓度不变。将3复孔的计数结果求平均值，描绘生长曲线。用MTT法测定β-榄香烯对细胞增殖的影响，在酶标仪上测定对照组及样品组各孔在490nm波长的吸收值，计算相对增殖率。
1.4  统计学方法　所有参数均采用均数±标准差表示(x±s)，两组比较采用t检验，数据分析采用SPSS13.0统计分析软件，以P<0.05有统计学意义。
2  结果
2.1  测定β-榄香烯对HT-29和HepG2细胞生长曲线的影响
2.1.1  β-榄香烯对HT-29细胞生长曲线的影响表  β-榄香烯组与对照组细胞数相比，在培养的第6、7d，细胞数减少，统计学上有显著差异(P<0.01)，在培养的第8d，β-榄香烯组细胞数减少，有显著差异(P<0.05)。与对照组相比，β-榄香烯组在培养的第6d、第7d、第8d能显著抑制HT-29细胞增殖。结果见表1，图1。
2.1.2  β-榄香烯对HepG2细胞生长曲线的影响 β-榄香烯组与对照组的细胞数相比，在培养的第6d，10μg/mlβ-榄香烯组细胞数减少，有显著差异(P<0.05)。与对照组相比，10μg/mlβ-榄香烯在培养的第6d能显著抑制HepG2细胞增殖。结果见表2，图2。
2.2  MTT法测定药物对细胞增殖的影响
2.2.1  β-榄香烯对HT-29细胞增殖的影响  MTT测定结果显示β-榄香烯对HT-29细胞增殖的抑制作用随作用时间延长，抑制效果更加明显。在第2d、第3d、第4d，与对照组相比，β-榄香烯对HT-29细胞增殖的抑制均有显著差异(P<0.05)。结果见表3。
2.2.2  β-榄香烯对HepG2细胞增殖的影响  MTT测定结果显示：β-榄香烯对HepG2细胞增殖的影响随作用时间延长，抑制效果更加明显。在第2d、第3d、第4d，与对照组相比，β-榄香烯组差异均显著(P<0.05)。结果见表4。
3  讨论
肝癌和结肠癌都是我国高发的恶性肿瘤。国际癌症研究中心(IARC)估计2000年全球肝癌发病56.4万，肝癌死亡54.9万，其中中国肝癌发病30.6万，肝癌死亡30.0万[4]。结肠癌的死亡率在恶性肿瘤中位于第三位，在初诊患者中，中晚期癌占大多数。近十年来，其5年生存率徘徊在50%左右[5]。因此，找到一个副作用小，且明确有效的治疗肝癌和结肠癌的药物十分重要。在文献中，已发现莪术提取物对肝癌和结肠癌具有一定的治疗效果，故本实验进行了莪术提取物对肝癌和结肠癌细胞系的研究。
本实验先用药物的三个剂量组进行了预实验：β-榄香烯30μg/ml、10μg/ml、3μg/ml。结果发现，β-榄香烯的大剂量组对细胞生长抑制明显；而小剂量组对细胞生长影响不大，故取有一定抑制效应的中剂量进行实验。结果发现：HT-29细胞于培养的第4d进入对数生长期，到第7d达到最大值。在培养的第6d、第7d，与对照组相比，β-榄香烯组的细胞数减少，统计学处理有显著差异(P<0.05)。由于第7d是正常对照组细胞数目最多的一天，故细胞数差异最明显。HepG2细胞由于生长较HT-29细胞旺盛，故于培养的第3d进入对数生长期，到第6d达到最大值。在培养的第6d，与对照组相比，10μg/mlβ-榄香烯组细胞数减少，统计学处理有显著差异(P<0.05)。β-榄香烯对两种细胞生长曲线影响的结果说明，β-榄香烯能发挥对HepG2细胞和HT-29细胞生长的抑制作用。
为了进一步明确β-榄香烯对两种细胞生长的影响，用MTT法测定了药物对细胞增殖的作用。MTT法的工作原理是活细胞或增殖旺盛细胞的线粒体在代谢过程中使可溶性的四唑蓝还原为不可溶的蓝紫色的甲瓒(Formazan, FM)结晶沉积于细胞内，而死亡细胞却无此功能，它可以间接地反应细胞的增殖情况，并与生长曲线有一定相关性[6]。当β-榄香烯抑制细胞增殖时，细胞线粒体的数目和功能就会受到影响，测定的O.D.值就较低。MTT测定结果显示：β-榄香烯对HT-29和HepG2细胞增殖的影响呈剂量依赖性，且随作用时间延长，抑制效果更加明显。对于HT-29细胞，β-榄香烯的大剂量组、中剂量组都有明确抑制细胞生长的效果。对于HepG2细胞，β-榄香烯的大剂量组、中剂量组都有明确的效果。MTT实验结果说明：在本实验的药物浓度条件下β-榄香烯具有一定的抑制HT-29和HepG2细胞增殖的作用。其实验结果与生长曲线结果基本一致。

参考文献
[1] 王文玲,文小平,黄韵红.希罗达/奥沙利铂联合榄香烯治疗老年进展期胃癌的临床研究.中国肿瘤临床,2006,33(18): 1069-1071.
[2] 赵越,江芳,张卓然.E.coliDNA抗肿瘤免疫的实验研究[J].免疫学杂志,2000,16(4):278-282.
[3] 周际昌.主编.抗肿瘤药物的疗效评价.实用肿瘤内科学[M].北京:人民卫生出版社,2003.45-47.
[4] Murphy JF, Fitzgerald DJ.Vascular endothelial growth factor induces cyclooxygenase-dependent proliferation of endothelial cells via the VEGF-2 receptor [J]. FASEB J, 2001,15:1667-1669.
[5] 曹阳,陈文娜,赵丹玉,等.榄香烯诱导人肺癌细胞株A549凋亡研究[J]. 辽宁中医药大学学报, 2008,10(4):146-147.
[6] Faivre J，Clerc J，Gerolami R,et al. Long-term radioiodine retention and regression of liver cancer after sodium iodide symporter gene transfer in wistar rats[J].Cancer Res,2004,64(21):8045-8051.

β-榄香烯是由碳、氢两种元素组成的倍半萜烯类化合物，药理学及临床研究证明β-榄香烯是一种疗效确切的非细胞毒性抗肿瘤药物，具有良好的抗癌活性，且其抗癌作用还有一定的特异性[1]。目前β-榄香烯作为一种新型的抗癌药物正发挥着越来越重要的作用，其临床应用越来越受到重视，主要用于治疗颅内肿瘤、治疗呼吸道肿瘤、胃癌等。肝癌和结肠癌都属于实体肿瘤，在其肿瘤的发生中，血管的生成十分重要。如果药物能对肝癌和结肠癌细胞发挥诱导凋亡和抑制血管生成作用，则具有抗肿瘤活性。而目前有关β-榄香烯治疗肝癌和结肠癌目前尚未见报道，因此本实验通过β-榄香烯对肝癌HepG2细胞和结肠癌HT-29细胞生长的影响，探讨β-榄香烯的抗癌作用，为临床上利用β-榄香烯治疗肿瘤提供理论依据。
1  材料与方法
1.1  细胞株：细胞株为来源于人的肝癌细胞株HepG2和结肠癌细胞株HT-29，购自中国科学院上海细胞生物研究所。
1.2  药品与仪器  药品：β-榄香烯乳注射液(大连金港制药有限公司)，试剂为分析纯。主要仪器：550型酶标仪(BIO-RAD公司)、XDS-1B倒置显微镜(重庆光学仪器厂)、SW-CJ-2F超净化工作台(苏州净化设备有限公司)、2306-2二氧化碳孵箱(SHELLAB公司)、984型低温冰箱(Forma公司)等。
1.3  方法 在37℃、5%CO2条件下，用含10%FBS的低糖DMEM培养HepG2和HT-29细胞。将培养2d的HepG2和HT-29细胞经0.25%的胰酶消化，制成1×104/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，各240孔，每孔200μl。将β-榄香烯加入孔中，使其终浓度分别为27μg/ml，27μg/ml，10μg/ml；另设置一个不加药物的对照组。以接种细胞的当天为0d，分别于1～8d取每个组的细胞，按照常规方法进行记数。在计数过程中，每隔2d换一次培养液，换液后维持药物浓度不变。将3复孔的计数结果求平均值，描绘生长曲线。用MTT法测定β-榄香烯对细胞增殖的影响，在酶标仪上测定对照组及样品组各孔在490nm波长的吸收值，计算相对增殖率。
1.4  统计学方法　所有参数均采用均数±标准差表示(x±s)，两组比较采用t检验，数据分析采用SPSS13.0统计分析软件，以P<0.05有统计学意义。
2  结果
2.1  测定β-榄香烯对HT-29和HepG2细胞生长曲线的影响
2.1.1  β-榄香烯对HT-29细胞生长曲线的影响表  β-榄香烯组与对照组细胞数相比，在培养的第6、7d，细胞数减少，统计学上有显著差异(P<0.01)，在培养的第8d，β-榄香烯组细胞数减少，有显著差异(P<0.05)。与对照组相比，β-榄香烯组在培养的第6d、第7d、第8d能显著抑制HT-29细胞增殖。结果见表1，图1。
2.1.2  β-榄香烯对HepG2细胞生长曲线的影响 β-榄香烯组与对照组的细胞数相比，在培养的第6d，10μg/mlβ-榄香烯组细胞数减少，有显著差异(P<0.05)。与对照组相比，10μg/mlβ-榄香烯在培养的第6d能显著抑制HepG2细胞增殖。结果见表2，图2。
2.2  MTT法测定药物对细胞增殖的影响
2.2.1  β-榄香烯对HT-29细胞增殖的影响  MTT测定结果显示β-榄香烯对HT-29细胞增殖的抑制作用随作用时间延长，抑制效果更加明显。在第2d、第3d、第4d，与对照组相比，β-榄香烯对HT-29细胞增殖的抑制均有显著差异(P<0.05)。结果见表3。
2.2.2  β-榄香烯对HepG2细胞增殖的影响  MTT测定结果显示：β-榄香烯对HepG2细胞增殖的影响随作用时间延长，抑制效果更加明显。在第2d、第3d、第4d，与对照组相比，β-榄香烯组差异均显著(P<0.05)。结果见表4。
3  讨论
肝癌和结肠癌都是我国高发的恶性肿瘤。国际癌症研究中心(IARC)估计2000年全球肝癌发病56.4万，肝癌死亡54.9万，其中中国肝癌发病30.6万，肝癌死亡30.0万[4]。结肠癌的死亡率在恶性肿瘤中位于第三位，在初诊患者中，中晚期癌占大多数。近十年来，其5年生存率徘徊在50%左右[5]。因此，找到一个副作用小，且明确有效的治疗肝癌和结肠癌的药物十分重要。在文献中，已发现莪术提取物对肝癌和结肠癌具有一定的治疗效果，故本实验进行了莪术提取物对肝癌和结肠癌细胞系的研究。
本实验先用药物的三个剂量组进行了预实验：β-榄香烯30μg/ml、10μg/ml、3μg/ml。结果发现，β-榄香烯的大剂量组对细胞生长抑制明显；而小剂量组对细胞生长影响不大，故取有一定抑制效应的中剂量进行实验。结果发现：HT-29细胞于培养的第4d进入对数生长期，到第7d达到最大值。在培养的第6d、第7d，与对照组相比，β-榄香烯组的细胞数减少，统计学处理有显著差异(P<0.05)。由于第7d是正常对照组细胞数目最多的一天，故细胞数差异最明显。HepG2细胞由于生长较HT-29细胞旺盛，故于培养的第3d进入对数生长期，到第6d达到最大值。在培养的第6d，与对照组相比，10μg/mlβ-榄香烯组细胞数减少，统计学处理有显著差异(P<0.05)。β-榄香烯对两种细胞生长曲线影响的结果说明，β-榄香烯能发挥对HepG2细胞和HT-29细胞生长的抑制作用。
为了进一步明确β-榄香烯对两种细胞生长的影响，用MTT法测定了药物对细胞增殖的作用。MTT法的工作原理是活细胞或增殖旺盛细胞的线粒体在代谢过程中使可溶性的四唑蓝还原为不可溶的蓝紫色的甲瓒(Formazan, FM)结晶沉积于细胞内，而死亡细胞却无此功能，它可以间接地反应细胞的增殖情况，并与生长曲线有一定相关性[6]。当β-榄香烯抑制细胞增殖时，细胞线粒体的数目和功能就会受到影响，测定的O.D.值就较低。MTT测定结果显示：β-榄香烯对HT-29和HepG2细胞增殖的影响呈剂量依赖性，且随作用时间延长，抑制效果更加明显。对于HT-29细胞，β-榄香烯的大剂量组、中剂量组都有明确抑制细胞生长的效果。对于HepG2细胞，β-榄香烯的大剂量组、中剂量组都有明确的效果。MTT实验结果说明：在本实验的药物浓度条件下β-榄香烯具有一定的抑制HT-29和HepG2细胞增殖的作用。其实验结果与生长曲线结果基本一致。

参考文献
[1] 王文玲,文小平,黄韵红.希罗达/奥沙利铂联合榄香烯治疗老年进展期胃癌的临床研究.中国肿瘤临床,2006,33(18): 1069-1071.
[2] 赵越,江芳,张卓然.E.coliDNA抗肿瘤免疫的实验研究[J].免疫学杂志,2000,16(4):278-282.
[3] 周际昌.主编.抗肿瘤药物的疗效评价.实用肿瘤内科学[M].北京:人民卫生出版社,2003.45-47.
[4] Murphy JF, Fitzgerald DJ.Vascular endothelial growth factor induces cyclooxygenase-dependent proliferation of endothelial cells via the VEGF-2 receptor [J]. FASEB J, 2001,15:1667-1669.
[5] 曹阳,陈文娜,赵丹玉,等.榄香烯诱导人肺癌细胞株A549凋亡研究[J]. 辽宁中医药大学学报, 2008,10(4):146-147.
[6] Faivre J，Clerc J，Gerolami R,et al. Long-term radioiodine retention and regression of liver cancer after sodium iodide symporter gene transfer in wistar rats[J].Cancer Res,2004,64(21):8045-8051.

表1β-榄香烯对HT-29细胞生长曲线的影响（）

注：与对照组比较，^*P<0.05有显著性差异